姜黄素对LPS诱导的星形胶质细胞炎性反应的抑制作用

郭敏芳，张慧宇，刘华

山西大同大学医学院组织胚胎学教研室，山西大同 037009

姜黄素对LPS诱导的星形胶质细胞炎性反应的抑制作用

郭敏芳，张慧宇，刘华

山西大同大学医学院组织胚胎学教研室，山西大同 037009

目的 探讨脂多糖 （LPS）诱导星形胶质细胞产生炎性反应及姜黄素对它的抑制作用。方法 在2015年3月—2015年7月期间，分离培养了10只新生1～2 d的昆明小鼠大脑皮质星形胶质细胞，培养10 d后传代分组，实验分PBS对照组（n=6）、LPS刺激组（n=6）、LPS联合姜黄素干预组（n=6）。ELISA检测炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的释放。结果 与PBS组的IL-6（873.82±20.28）、IL-1β（680.62±10.35）和TNF-α（492.73±8.56）比较，LPS刺激组IL-6（1132.42±78.09）、IL-1β（821.87±14.33）和TNF-α（559.32±9.6）的分泌增加（P＜0.05）；姜黄素能显著抑制 LPS诱导的IL-6（1014.79±52.08）、IL-1β（738.84±7.33）和 TNF-α（476.7±10.38）的分泌，与 LPS组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 姜黄素能抑制LPS激活星形胶质细胞所致的炎性反应。

脂多糖；星形胶质细胞；姜黄素；炎性反应

近年来研究发现星形胶质细胞 （astrocyte AST）可以调节中枢免疫反应，在多种神经免疫性疾病的病理生理过程中发挥关键作用。AST可以通过增加血脑屏障的通透性，分泌各种炎性因子和趋化因子，比如IL-6、IL-1β和TNF-α等，抑制轴突和髓鞘再生等机制促进神经免疫性疾病的严重程度[1]。姜黄素（curcumin Cur）是姜黄中色素类化合物的主要成分，具有多种生物活性，比如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤及免疫调节等药理作用。有研究认为，Cur可以通过调节NO合成和分泌，抑制NF-κB信号途径等机制发挥抗炎作用[2]。

该次试验在2015年3月—2015年7月期间，取了10只新生1～2 d昆明小鼠，原代培养的大脑皮质AST，培养10 d后将细胞传代分组，观察Cur对LPS诱导的AST炎性反应的影响。为临床上应用Cur治疗神经炎性病提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

10只清洁级饲养条件下的新生1～2 d昆明小鼠由山西大同大学医学院动物中心提供 （符合国际上拟定的动物公约）；LPS和Cur购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自美国PeproTech公司；胎牛血清（FBS）和高糖DMEM均购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠AST培养 无菌条件下取出1～2 d昆明小鼠的大脑皮质，剥除残余脑膜及血管后用预冷的PBS液清洗3次，吹打制成单细胞悬液，离心后弃上清，沉淀用AST基本培养液(含10%FBS的高糖DMEM)重新悬浮。接种于预先用L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被的培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，24 h后换液去除组织碎片及未贴壁的细胞。以后每3 d换液1次直到细胞达到80%～90%的融合，然后置于恒温摇床，37℃、180转/min离心18 h，去除上层的少突胶质细胞和小胶质细胞[3]。然后胰酶消化传代培养。将第2代AST以1.5× 106/mL的密度接种于6孔板中，24 h后换液，实验分三组:PBS对照组、LPS（1 μg/mL）刺激组、LPS（1 μg/mL）联合Cur（10 μmol/L）干预组。作用24 h后收集培养上清液冰冻保存。

1.2.2 ELISA法检测AST上清液中炎性因子的含量收集各组AST培养上清液，按ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α，检测各组样品在450 nm的光密度值。参照各细胞因子的标准曲线计算出含量，以pg/mL表示其结果。

1.3 统计方法

所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计数资料均以（）表示。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果表明，LPS诱导后AST分泌 IL-6、IL-1β和TNF-α明显增加 (P＜0.05)；与LPS组相比，Cur干预组IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌显著下降 (表1，P＜0.05)，差异有统计学意义。

表1 Cur对LPS刺激AST释放炎性因子的影响（）

表1 Cur对LPS刺激AST释放炎性因子的影响（）

组别IL-6 IL-1β TNF-α PBS组（n=6）LPS组（n=6）LPS+Cur组（n=6）873.82±20.28 1132.42±78.09 1014.79±52.08 680.62±10.35 821.87±14.33 738.84±7.33 492.73±8.56 559.32±9.6 476.7±10.38

3 讨论

在CNS的感染、损伤及多种病变过程中均伴有发生在脑实质中的非典型炎性反应，这种局部炎性反应不涉及外周免疫系统，只有有限的白细胞浸润，这一反应过程称为神经炎性反应[4]。虽然小胶质细胞被认为是存在于CNS的固有免疫细胞，但是AST可以通过清除细胞间的毒素和细胞碎片，调节免疫炎性反应，保护神经元免受内源性和外源性毒性损伤。越来越多的证据证明AST在神经炎性反应过程中发挥着关键作用[5]。

LPS是存在于革兰氏阴性菌外膜的一种内毒素，是脓毒症的触发因素，常引起全身炎症反应，甚至引发多器官功能衰竭。有研究显示，LPS可以诱导AST产生多种炎性细胞因子，比如NO、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6和IL-8等[1]。并且LPS激活的AST可以引起NF-κB炎性反应通路活化。NF-κB是一种功能多样的核转录因子，是机体炎性、免疫和氧化应激等反应中的关键调节因子[6]，比如，NF-κB可以调控TNF-α、IL-1β和诱导型环氧合酶(COX-2)的表达，而COX-2参与花生四烯酸类物质和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，iNOS又能介导NO的释放[7]。而且越来越多的证据表明这些物质的释放可导致与多种神经性疾病有关的兴奋毒作用，促进神经退行性疾病的炎症病理过程，最终引起神经元的死亡[8]。我们的结果显示，LPS刺激可以引起AST分泌IL-6、TNF-α和IL-1β明显增加。因此，寻找有效的抗炎药物减少AST的激活，成了治疗多种神经退行性疾病的重要思路。

体内实验证实，Cur可以穿过血脑屏障并且保持高生物活性[9]。近年来Cur的神经保护作用被广泛研究，Cur对多种CNS的炎性和神经退行性疾病具有预防和治疗作用，比如阿尔茨海默病、心脑血管病、帕金森病等[10]。有研究表明，Cur能够抑制LPS引起的小胶质细胞激活及分泌炎性因子的增加，但是到目前为止，关于Cur抑制LPS激活 AST炎性反应的研究则少有报道。该研究结果显示，Cur可以抑制LPS刺激AST引起的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的高表达，进一步证明Cur具有抗神经炎性作用。

综合以上实验结果，LPS刺激AST诱导炎性因子分泌增加，从而导致神经损伤。而Cur可以有效的抑制AST炎性反应，为神经炎症患者的治疗提供希望和帮助，但是其确切机制还需进一步研究。

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[2]Wang J,Zhu R,Sun D,et al.Intracellular Uptake of Curcumin-Loaded Solid Lipid Nanoparticles Exhibit Anti-InflammatoryActivities Superior to Those of Curcumin Throughthe NF-κB Signaling Pathway[J].J Biomed Nanotechnol,2015，11(3):403-415.

[3]辛岗，苏芸，张娟，等.星形胶质细胞纯化方法改良及脂多糖刺激后一氧化氮系统的表达[J].广东医学，2011，32(4): 429-431．

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In Astrocyte Stimulated with Lipopolysaccharide

GUO Min-fang，ZHAGN Hui-yu，LIU Hua
Department of histology and embryology,Medical School,Shanxi Datong University,Datong,Shanxi Province,037009 China

Objective To investigate the inflammatory response in astrocytes induced by lipopolysaccharide (LPS)and the inhibition of curcumin on inflammatory response.Methods And the PBS group IL-6(873.82±20.28)IL-1 beta(680.62± of 10.35)TNF-a and(492.73±8.56),LPS stimulated IL-6 group(1132.42±78.09),IL-1 beta(821.87±14.33),and TNF-(559.32±9.6)secretion increased(P＜0.05);curcumin could significantly inhibit the LPS induced IL-6(1014.79±52.08), interleukin 1 IL-1 (738.84±7.33)and tumor necrosis factor alpha(476.7±10.38)secretion,and LPS group compared to the difference was statistically significant(P＜0.05).Results Compared with IL-6（873.82±20.28）、IL-1β（680.62±10.35）and TNF-α（559.32±9.6）of PBS control group，LPS significantly increased the production of IL-6（1132.42±78.09）、IL-1β（821.87±14.33）and TNF-α（559.32±9.6）(P＜0.05).Cur treatment inhibited LPS-induced IL-6（1014.79±52.08）、IL-1β（738.84±7.33）and TNF-α（476.7±10.38）production compared with LPS stimulated group,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Cur could inhibit LPS-induced inflammatory response in astrocytes.

Lipopolysaccharide;Astrocyte cell;Lipid;Inflammatory response

R28

A

1674-0742（2016）06（b）－0018-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.17.018

2016-03-18）

山西大同大学2011年度青年科学研究基金项目（NO.2011Q13）。

郭敏芳（1980－），女，山西广灵人，硕士，讲师，主要从事组织胚胎学的教学工作。