MiR200对肾癌细胞增殖的影响分析

施莹，林玲，阚佳音，刘海燕，马增伟，李双宇

1.齐齐哈尔医学院第三附属医院肾内科，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院病理学院微形态实验中心，黑龙江齐齐哈尔 161000

MiR200对肾癌细胞增殖的影响分析

施莹1，林玲1，阚佳音1，刘海燕2，马增伟1，李双宇1

1.齐齐哈尔医学院第三附属医院肾内科，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院病理学院微形态实验中心，黑龙江齐齐哈尔 161000

目的 研究MiR200对肾癌细胞增殖的影响。 方法 整群选取2013年1月—2015年1月于齐齐哈尔医学院第三附属医院就诊的51例肾癌患者病理细胞和正常癌旁组织细胞，以及构建裸鼠肾癌模型，测量MiR-200在不同细胞中的表达量和肿瘤增殖情况。 结果MiR-200在裸鼠的SN12-PM6和人的786-o、A498表达中均低于正常组织的表达（P＜0.05），在48 h后能够抑制肾癌细胞增殖（P＜0.05），48～72 h抑制情况最为显著（P＜0.05）。 结论 MiR-200在肿瘤细胞中呈低表达水平，能够抑制肾癌细胞增殖并能够抑制裸鼠肾癌细胞生长。

MiR200；肾癌细胞；增殖

临床上发现肾癌的患病例数逐年增加，而通常肾癌晚期已经失去了最佳手术机会，放疗和化疗成为了治疗肾癌的主要手段[1]。研究发现[2-3]，MiRNAs在肿瘤发生过程中具有重要作用，可能会影响肿瘤细胞增殖，该研究以2013年1月—2015年1月于齐齐哈尔医学院第三附属医院就诊的51例肾癌患者和BALB/C裸鼠为研究对象，旨在研究MiR200对肿瘤细胞增殖的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究经院伦理委员会批准并取得患者知情同意。整群选取2013年1月—2015年1月该齐齐哈尔医学院第三附属医院肾癌住院患者51人病理资料，其中男28人，女23人，年龄43～78岁，平均（62.63±4.89）岁。所有患者均经病理学检查确诊为肾癌[4]，未合并糖尿病等其他脏器功能障碍。实验用20只BALB/C裸鼠购自北京市疾病预防控制中心，4～5周，16～18 g，随机分为两组，每组各10只，分别为MiR-Ctr组和MiR-200组，均按照SOF级环境饲养并按照动物建模手术操作原则进行操作。鼠源肾癌细胞株SN12-PM6，人源肾癌细胞株A498和786-o购自北京协和医学院基础医学院细胞中心。用MTT法检测MiR-200对肾癌细胞的增殖抑制率。

1.2 裸鼠建模及肾癌肿瘤细胞生长检测

裸鼠肾SN12-PM6细胞，培养至对数生长期，消化离心PBS重悬，冰上保存。裸鼠腹腔注射1%水合氯醛溶液麻醉，将已备好的细胞悬液20 μL植于鼠左侧肾脏实质内，缝合皮肤，置于SPF下饲养。隔日观察裸鼠体重，第5周时用影像学方法检测肿瘤细胞生长情况。第6周末处死裸鼠，解剖取其双肾，称量双肾后用4%多聚甲醛溶液固定，制作石蜡、切片并进行HE染色及免疫组化反应

1.3 MiR200的表达量检测

选取融合度达到90%以上并处于对数生长期的细胞，PBS冲洗后，Trizol法提取总RNA.提取的RNA经RT master mix法逆转录成cDNA,进行定量PCR扩增以U6为参照，取癌旁组织平均值，使用2-△△Ct计算肾癌细胞中MiR-200的表达倍数。选取处于对数生长期的细胞，Trizol法提取总RNA.提取的RNA经RT master mix法逆转录成cDNA,进行定量PCR扩增以U6为参照，取癌旁组织平均值，使用2-△△Ct计算肾癌细胞中MiR-200的表达倍数。

1.4 统计方法

数据运用SPSS 17.0统计学软件进行录入、分析。计量资料采用（）表示，多组间比较采用方差分析检验，计数资料采用[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌细胞株中MiR-200的表达

以人正常组织平均值为对照，MiR-200在肾癌细胞中表达值显著降低，各细胞培养组间与对照组均有差异，差异有统计学意义。见表1。

表1 两组细胞侵袭能力比较()

表1 两组细胞侵袭能力比较()

细胞株平均表达量F P Normal（n=51）SN12-PM6（n=20）786-o（n=51）A498（n=51）1.014±0.005 0.027±0.003 0.041±0.011 0.062±0.009 14.872 ＜0.001

2.2 MiR-200对肾癌细胞增殖影响

使用MTT法于24、48、72、96 h和120 h检测肾癌细胞抑制率情况，SN12-PM6与786-o均对肾癌细胞有抑制作用，24 h内变化不显著，48～72 h，MiR-200增长明显放缓，超过72 h，抑制达到平台期。见表2。

2.3 MiR-200抑制裸鼠肾脏肿瘤生长情况

两组肿瘤形成率均为100%，形成率无差异，但MiR-200肿瘤重量明显低于对照组，且免疫组化结果显示，MiR-200的阳性率 （20%）也显著低于对照组（80%）。见表3。

3 讨论

随着人类基因组计划不断进展，超过 1500个MiRNA已被发现，发现其调控超过30%的蛋白质编码基因，MiRNA不仅参与人体重要的正常生理活动，而且还参与疾病的发生与发展[5]。研究表明[7]，超过一半的MiRNA位于肿瘤发生的基因上，和肿瘤关系密切。目前已证实MiRNA与多种肿瘤相关，而肾癌相关研究却报道很少，该研究证实MiR-200在肾癌细胞中表达量明显低于癌旁组织，因此推断MiR-200在肾癌的发生、生长、转移、侵袭中具有重要作用，通另根据不同时间截点测量人与裸鼠的抑制肾癌细胞增长发现，48～72 h，肾癌细胞抑制水平最为明显，抑制率较高。而在裸鼠实验中通过CDK2免疫组化染色比较，说明MiR-200能够调节CDK2这个靶基因，从而抑制肾癌细胞的发生发展。研究表明[8]，每个MiRNA具有多个靶点，而一个靶点也同样有多个MiRNAs对应，如MiR-200可调节细胞上皮间质的转化[9]，可调节细胞凋亡[10]，该研究尚未针对具体位点和MiR-200作用降解靶基因的翻译抑制机制以及不同阶段阻断细胞周期的研究，为下一步更系统深化的研究提出了新的方向与要求。

表2 MiR-200抑制肾癌增殖情况比较()

表2 MiR-200抑制肾癌增殖情况比较()

组别24 h 48 h 72 h 96 h 120 h SN12-PM6 miR-Ctr（n=20）miR-200（n=20）tP 786-o miR-Ctr（n=51）miR-200（n=51）tP 0.27±0.002 0.23±0.004 0.343 0.785 0.31±0.003 0.30±0.002 0.002 1.000 0.51±0.010 0.37±0.007 2.443 0.038 0.72±0.004 0.49±0.002 2.776 0.009 1.13±0.008 0.54±0.019 4.098＜0.001 1.97±0.006 1.01±0.009 5.473＜0.001 2.16±0.011 1.32±0.017 5.009＜0.001 2.53±0.006 1.55±0.004 5.558＜0.001 2.23±0.004 1.62±0.022 5.983＜0.001 2.65±0.012 2.02±0.010 4.972＜0.001

表3 两组裸鼠肿瘤重量比较[(),mg]

表3 两组裸鼠肿瘤重量比较[(),mg]

综上所述，MiR-200在肾癌的增殖过程中具有重要意义，但是还需要具体明确MiRNA对下游靶基因的调控和反馈表达作用，也为肾癌如何抑制肿瘤提出了新的要求。

[1]王雪刚.MiR-200c抑制肾癌细胞增殖和侵袭转移的机制研究[D].武汉：华中科技大学，2013.

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[4]那彦群，孙光，叶章群，等．中国泌尿外科疾病诊断治疗指南（2014）[M]．北京：人民卫生出版社，2013.

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[7]Schena,F.P,Serino,G.,Sallustio,F.MicroRNAs in kidney diseases:New promising biomarkers for diagnosis and monitoring[J].2014,29(4):154-163.

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Analysis of the Effect of MiR200 on the Proliferation of Renal cell Carcinoma Cells

SHI Ying1,LIN Ling1,KAN Jia-yin1,LIU Hai-yan2,MA Zeng-wei1,LI Shuang-yu1
1.The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Department of Nephrology，Qiqihar，Heilongjiang Province, 161000 China;2.College of Pathology,Qiqihar Medical University,Micromorphological Experimental Center,Qiqihar，Heilongjiang Province,161000 China

Objective MiR200 proliferation of kidney cancer.Methods Group selection from January 2013-January 2015, 51 patients in the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University with renal cell carcinoma pathological cells and adjacent normal tissue cells,renal cancer and build nude model,measuring MiR-200 in different cells and the expression of tumor proliferation.Results MiR-200 in nude mice SN12-PM6 and human 786-o,A498 expression were lower than normal tissue expression(P＜0.05),at 48h after kidney can inhibit cancer cell proliferation(P＜0.05),48～72 h inhibition was most significant,(P＜0.05).Conclusion MiR-200 showed low levels of expression in tumor cells,can inhibit the proliferation of renal cell carcinoma and renal cancer cell growth in nude mice can be suppressed.

MiR200；Renal cell carcinoma；proliferation

R737.11

A

1674-0742（2016）06（b）－0023-02

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.17.023

2016-03-18）

齐齐哈尔市科学技术计划项目任务（FSGG201422）。

施莹（1975.6-），女，本科，副主任医师,研究方向：肾脏疾病。