高效液相色谱法检测间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠

姚丽利，施介华，2

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.浙江工业大学绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江杭州310014）

分析测试

高效液相色谱法检测间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠

姚丽利1，施介华1，2

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.浙江工业大学绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江杭州310014）

采用高效液相色谱法同时测定间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸。考察了流动相比例、流动相pH等影响因素，并对选定的色谱条件进行了方法学的验证。结果表明：使用Waters Atlantis C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5.0μm)，流动相为磷酸二氢钾溶液：甲醇=9∶1，其中磷酸二氢钾溶液浓度为20 mmol/L，pH为3.5，检测波长220 nm，流速为1 mL/min，柱温为25℃能达到分离效果，此方法的精密度、线性和回收率均达到要求。该方法分析快速准确、灵敏度高、重现性好。

闭口闪点；车用柴油；标准不确定度评估

间氨基苯磺酸是一种重要的化工中间体，在偶氮染料、医药、农药、显影剂等领域应用广泛[1-4]。间氨基苯磺酸的传统制备方法是采用铁粉还原间硝基苯磺酸钠，并酸化得到的，但该方法生产过程中产生大量废酸，污染严重[5，7]。另外还可以采用电化学法合成[6-7]，只是耗电量很大、成本过高。而在文献中也有许多使用金属催化剂催化加氢制备间氨基苯磺酸的报道[7-9]，此方法不仅符合绿色生产的要求，且产品质量好。传统上分析间氨基苯磺酸纯度是测定氨基值，此方法滴定过程繁琐，且准确性差。白雪松等[10]用四乙基溴化铵做离子对色谱分析间氨基苯磺酸和其杂质。

本文使用Waters 2695-2996高效液相色谱仪，在Waters Atlantis C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）上，流动相为磷酸二氢钾溶液：甲醇=9∶1，其中磷酸二氢钾溶液浓度为20 mmol/L，pH为3.5，检测波长220 nm，流速为1 mL/min，柱温为25℃，在此条件下，能很好的分离间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸以及杂质，并对此色谱条件进行方法学的验证，精密度、线性和回收率均达到要求。此方法分离效能高，分析快速准确、灵敏度高、重现性好，测定结果令人满意。适用于间氨基苯磺酸生产过程的动态监测及产品质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Alliance 2695型高效液相色谱仪，配2996二极管阵列检测器和Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Waters Atlantis C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）（美国Waters公司）；AL-204电子天平（TETTLER TOLEDO）；PS-10A超声波清洗机（洁康公司）；pHS-4型酸度计（杭州亚美电子仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵；1810B自动双重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器厂）。间硝基苯磺酸钠（Aladdin industrial corporation）；间氨基苯磺酸（Aladdin industrial corporation）；磷酸二氢钾（湖州化学试剂有限公司），甲醇（天津四友）；二次蒸馏水。

1.2 溶液配制

磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾2.7218 g，超声溶解，转移至1 L容量瓶中，用双蒸水定容至刻度，配成20 mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用质量分数为85%的磷酸溶液调节至所需pH，过滤后待用。

标准溶液：分别称取100 mg间硝基苯磺酸钠标准品和间氨基苯磺酸标准品，置于100 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，充分摇匀，配成1mg/mL的标准溶液。

样品溶液：用移液管量取1 mL反应液于100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，充分摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后待用。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流动相：20 mmol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇=9：1（其中磷酸二氢钾溶液的pH为3.5）；进样量：10μL；流速：1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：220 nm。

2 结果和讨论

2.1 色谱分离条件的选择

2.1.1 波长的选择

在实验过程中作者发现间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸的保留时间相差比较大，分离度较好，能实现较好的分离。其中间氨基苯磺酸的保留时间较短，同时，作者发现了一个杂质，其保留时间与间氨基苯磺酸接近，甚至在某些色谱条件下，杂质并不能被检出，所以选择波长需要考虑间硝基苯磺酸钠、间氨基苯磺酸和杂质能同时被检出。图1是间氨基苯磺酸，间硝基苯磺酸钠及杂质的紫外吸收光谱图。从图中可见，三者的最大吸收波长差异较大。杂质的最大吸收波长为248 nm，间氨基苯磺酸的最大吸收波长为237 nm，间氨基苯磺酸的最大吸收波长为260 nm，为了提高间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠的检测灵敏度，且为了得到的峰型良好，选择末端吸收的220 nm为检测波长。

2.1.2 流动相比例的选择

表1是磷酸二氢钾溶液和甲醇比例变化对间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠保留行为的影响。从表中可见，间氨基苯磺酸保留时间较短，保留较弱，且随着流动相中磷酸二氢钾溶液和甲醇比例变化，其保留时间变化不是很大；但还是可以发现随着甲醇比例变小，间氨基苯磺酸的保留时间略有变长。而间硝基苯磺酸钠保留时间适当，保留较好，且随着流动相中磷酸二氢钾溶液和甲醇比例变化，其保留时间变化比较明显；随着甲醇比例变小，间硝基苯磺酸钠的保留时间明显变长。随着流动相中磷酸二氢钾溶液和甲醇比例变化，间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠两者都能有较好分离。

图1 间氨基苯磺酸（a），间硝基苯磺酸钠（b）及杂质（c）的紫外吸收光谱图Figure 1 Ultraviolet absorption spectrum of 3-aminobenzenesulfonic acid（a），sodium 3-nitrobenzenesulfonate（b）and impurity（c）

杂质与间氨基苯磺酸的保留时间很接近，由表1可知，有机相比例不够低时，杂质与间氨基苯磺酸共同出峰，所以在间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠分离和检测中主要是要考察将杂质和间氨基苯磺酸能够分开的条件。

虽然间氨基苯磺酸和杂质的保留时间都比较短，但是杂质的保留时间比间氨基苯磺酸更短，且可以明显发现，随着甲醇比例的减小，杂质和间氨基苯磺酸有逐渐分离的趋势。当流动相中20 mmol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇=8∶2时杂质和间氨基苯磺酸的分离度为1.332，未达到分离的要求，而当流动相中20 mmol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇=9∶1时杂质和间氨基苯磺酸的分离度为2.483，达到分离的要求，所以选择此流动相比例作为分离的流动相。

表1 pH为3.5时不同流动相比例下的保留时间和分离度Table 1 Retention time and resolution of pH for 3.5 by differentmobile phase

2.1.2 pH的选择

在选定流动相比例的情况下，研究在不同pH条件下杂质、间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠的保留时间以及间氨基苯磺酸和杂质的分离度情况，结果如表2所示。结果表明，间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠保留时间随流动相pH值增大而增大，间氨基苯磺酸钠与杂质间的分离度随pH值增大先增大再减小。当pH=2.5时，杂质与间氨基苯磺酸钠分离度为1.18，当pH=3.0～3.5时，杂质与间氨基苯磺酸钠的分离效果较好，分离度达2.48～2.53，即达基线分离。当pH=4.0时，虽然分离度大于1.5，但是间硝基苯磺酸钠拖尾现象严重。因此选择了流动相pH=3.5。

表2 20 mmol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇=9：1时不同pH下的保留时间和分离度Table 2 Retention time and resolution of 20 m mol/L potassium dihydrogan phosphate solution：methanol=9∶1 for different pH

通过流动相组成和流动相pH值的选择，确定民时分离测定间氨基苯磺酸钠和间硝基苯磺酸钠的色谱条件为：

色谱柱：Waters Atlantis C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流动相：20 mmol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇=9∶1（其中磷酸二氢钾溶液的pH为3.5）；进样量：10μL；流速：1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：220 nm。

在此色谱条件下，间氨基苯磺酸钠试样中间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠以及杂质间具有良好分离效果，见图2。

图2 间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸混合液的高效液相色谱图Figure 2 High performance liquid chromatogram figure of the mixture of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-aminobenzenesulfonic acid

2.2 线性范围的测定

将不同浓度的间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸标准溶液在上述选定的色谱测定条件下混合进样进行分析测定，进样体积为10μL。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果如图3所示，在试验的浓度范围内，间硝基苯磺酸钠和间氨基苯磺酸与其峰面积均呈现良好的线性关系，其中间硝基苯磺酸钠的线性回归方程为A1=2.4653C1-0.0003（R2=0.9979），间氨基苯磺酸的线性回归方程为A2=1.6411C2+0.0534（R2= 0.9995）。

图3 间硝基苯磺酸钠（a）和间氨基苯磺酸（b）标准曲线Figure 3 Standard curve of the sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid（a）and 3-aminobenzenesulfonic acid（b）

2.3 方法的精密度测定

为了考察该方法的精密度还做了重复性实验，对同一份试样用相同方法配制9份样品，分别进样，测得保留时间和峰面积结果如表3所示。

2.4 方法的回收率测定

在已知含量的样品中加入80%、100%、120%的标准品分别进样三次测定回收率，结果如表4所示。测得间硝基苯磺酸钠的回收率范围为100.57%～102.62%，平均回收率为101.50%。间氨基苯磺酸的回收率范围为98.03%～100.09%，平均回收率为98.86%。

2.5 样品检测

按照建立的液相方法，选取两批反应液进行测定，每个样品测定两次，结果表5所示。

表3 重复性实验的保留时间和峰面积Table 3 Retention time and peak area ofrepeated experiments

表4 间氨基苯磺酸和间硝基苯磺酸钠的回收率Table 4 The recovery of sodium 3-nitrobenzenesulfonic acid and 3-aminobenzenesulfonic acid

3 结论

以上结果数据显示，本文所建立的高效液相色谱法可以进行间硝基苯磺酸钠、间氨基苯磺酸和杂质的检测和分析，操作简单快速、灵敏准确，样品不需要任何预处理，适用于生产过程的动态监测及质量控制分析。

表5 反应液样品测定Table 5 Determination of reaction samples

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HPLC Method for the Determination of 3-Aminobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate

YAO Li-li1，SHIJie-hua1,2
(1.College of Phamaceutical Science，Zhejiang Universal of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China;2.State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry-Synthesis Technology，Zhejiang Universal of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China)

A high performance liquid chromatographic method was used to determine the 3-aminobenzenesulfonic Acid and Sodium 3-nitrobenzenesulfonate.The influencing factors such as the proportion of mobile phase and pH of mobile phase were investigated，and the methods of the selected chromatographic conditions were verified.Results show that using the waters Atlantis C18 column（4.6 mm×150 mm，5.0μm），with the mobile phase of potassium dihydrogan phosphate solution：methanol=9∶1，which concentration of potassium dihydrogan phosphate solution for 20 mmol/L and the pH of 3.5，the detection wavelength was 220 nm.The flow rate was 1 mL/min.The column temperature is 25℃.The method can achieve the separation effect and the method of of precision，linearity and recovery rate are all up to the requirements.The method is accurate，sensitive and reproducible.

HPLC；3-aminobenzenesulfonic acid；sodium 3-nitrobenzenesulfonate

1006-4184（2016）11-005-05

2016-06-28

姚丽利（1990-），女，研究方向：药物分析。E-mail：443795683@qq.com。

*通讯作者：施介华，男，教授，博士生导师。