革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的研究进展

王鸿，平夏婷，陈苏，潘秋，邵燕燕，陈小春，李钰金

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.山东省海洋食品营养研究院，山东荣成264309）

医药化工

革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的研究进展

王鸿1，平夏婷1，陈苏1，潘秋1，邵燕燕1，陈小春1，李钰金2

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.山东省海洋食品营养研究院，山东荣成264309）

群体感应是一种通过菌体密度来协同控制细菌特定基因表达的现象。由此产生的群体感应抑制剂在抑制细菌毒性基因表达时不会对细菌产生生长压力，从而避免了细菌耐药性的产生。这一新颖的抑菌机制使其在开发新型抗感染药物方面有很大潜力。研究中，简要描述了研究最广泛的革兰氏阴性菌群体感应系统、群体感应抑制剂的作用方法和来源类别。突出介绍了天然来源和化学合成两个方面的群体感应抑制剂，并且介绍了几种群体感应抑制剂的应用。

革兰氏阴性菌；群体感应抑制剂；天然来源；化学合成

群体感应（quorum sensing，QS）是一种通过菌体密度来协同控制细菌特定基因表达的现象。由此产生的群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSIs）是阻断细菌之间的沟通抑制毒素目的基因表达的物质。其中研究最为广泛的是革兰氏阴性菌的酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones，AHL）介导的LuxI-LuxR型QSIs。该物质通过抑制AHL合成，AHL降解或是阻断AHL与受体的结合来抑制特定基因的表达[1]。与传统的抗感染药物的抑菌机制相比，QSIs作用的过程中并不影响细菌的生长，因此不会引起细菌耐药性的产生。这一新颖的抑菌机制使其在开发新型抗感染药物方面有很大潜力。

1 QSIs来源

随着QS研究的不断深入，QSIs的来源也呈现出多样化的趋势。QSIs根据来源主要分为：天然来源和化学合成来源。天然来源QSIs通常具有新颖的结构，但其存在的主要限制是与有效浓度并存的相关毒性。我们可以通过化学合成它们绕过这些限制，在一定程度上减弱天然来源QSIs的细胞毒性，得到更高效的QSIs。天然来源的QSIs在化学结构上的多样性为化学合成提供了新型骨架，在一定程度上为化学合成QSIs提供借鉴。

1.1 天然来源QSIs

天然来源主要包括植物，动物和微生物。其中植物来源和微生物来源的QSIs占到天然来源QSIs的绝大部分。

1.1.1 植物来源QSIs

植物来源的QSIs研究较为广泛，最早发现海洋红藻（Delisa pulchra）中的溴代呋喃酮（5Z）-4-bromo-5-（bromomethylene）-3-butyl-2（5H）-furanone（1）可以阻断哈氏弧菌的生物荧光的产生[2]。木耳（Auricularia auricular）色素提取物，枇杷树中的鞣质成分，小茴香（Cuminum cyminum）中的甲基丁香酚1，2-dimethoxy-4-（2-propen-1-yl）benzene（2），大蒜中的蒜素Ajoene（3）等均对紫色杆菌有群体感应抑制作用[3]。山竹（Garcinia mangostana）中含有一系列含氧和异戊二烯的氧杂蒽酮类物质，它们已被发现具有抗微生物，抗肿瘤，抗炎，抗疟疾，抗病毒，抗分支杆菌，抗氧化剂和抗钩端螺旋体等不同的生物活性。近期Mohamed等人发现的两种新的氧杂蒽酮类物质mangostanaxanthones I（4），α-mangostin（5）能有效抑制紫色杆菌ATCC12472的紫色素的生成，具有群体感应抑制效果[4]。另外，传统中药新功能的发现也是一大亮点。云南白药水溶液在亚抑菌浓度（2.5 mg/mL）下能有效抑制铜绿假单胞菌的生物体膜形成，抑制LasA蛋白酶，LasB弹性蛋白酶和绿脓素的产生[5]。人参水提物也能有效的抑制铜绿假单胞菌中的LasA蛋白酶，LasB弹性蛋白酶的产生，并能抑制AHL的合成，但它会增加胞外蛋白的产量，刺激海藻酸钠的产生[6]。部分植物来源QSIs化学结构式见图1。这些报道为传统中草药的作用机制的深入研究指明了方向，同时也表明药用植物有效成分分离在未来QSIs寻找中具有重要地位。

图1 部分植物来源的QSIsFig.1 Partof QSIs from plants

1.1.2 动物来源QSIs

动物来源的QSIs相对来说较少。在入侵红火蚁（Solenopsis invicta）（分布于南美洲的一种危险性）害虫中提取的生物碱solenopsin A（6）可以阻断铜绿假单胞菌中依靠C4-HSL的rhl群体感应系统[7]。Skindersoe M E等人从澳大利亚大堡礁附近的海绵Luffariella variabilis中分离到了三种次级代谢产物manoalide（7），manoalidemonoacetate，secomanoalide（8）对铜绿假单胞菌LasB弹性蛋白酶基因的表达均有强烈抑制作用[8]。Quintana等人从哥伦比亚加勒比海和巴西湾中采集得到的26种海绵，7种软珊瑚和1种钮扣珊瑚中软珊瑚Eunicea laciniata，海绵Svenzea tubulosa，Ircinia felix和Neopetrosia carbonaria能有效抑制紫色杆菌ATCC31532的紫色素生产和QS报告菌株E.coli pSB401生物荧光的产生。海绵Ircinia felix中提取的（7Z，13Z，18R，20Z）-felixinin acetate（9），（8Z，13Z，18R，20Z）-strobilinin acetate（10），（7E，12E，18R，20Z）-variabilin acetate（11）等6种呋喃三萜化合物与AHL及其他已经发现的QSIs结构相似，因此具有类似的QS抑制机制[9]。部分动物来源的QSIs结构如图2所示。动物来源的稀缺性跟样品采集难度大有关，但是动物来源QSIs有很大的发掘潜力。

图2 部分动物来源QSIsFig.2 Part of QSIs from animals

1.1.3 微生物来源QSIs

微生物来源的QSIs主要包括各种群体感应猝灭酶和次级代谢产物。群体感应猝灭酶包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.），放线菌属（Streptomyces sp.），变性菌属（Proteobacteria sp.）中产生一些AHL-内酯酶、AHL-酰基转移酶、氧化还原酶等[10]。这些酶能将AHL分解成脂肪酸、高丝氨酸和其他氧化还原AHL，从而使信号分子失去活性。微生物次级代谢产物由于其代谢多样性而各不相同。Teasdale M E等人从Bacillus cereus D28中分离出的环（L-脯氨酸-L-酪氨酸）（12）能有效抑制哈氏弧菌的生物荧光的产生[11]。Abed M M等人在Marinobacter sp.SK-3中发现的二酮哌嗪类化合物环（L-脯氨酸-L-苯丙氨酸）（13），环（L-脯氨酸-L-异亮氨酸）（14）能有效抑制紫色杆菌CV017紫色素的产生。环（L-脯氨酸-L-苯丙氨酸），环（L-脯氨酸-L-异亮氨酸）和环（L-脯氨酸-L-亮氨酸）（15）均能抑制大肠杆菌pSB401生物荧光的产生[12]。当前发现的最新微生物来源QSIs是提取自S treptomyces xanthocidicus KPP01532的化合物glucopiericidin A（16）。该化合物能抑制紫色杆菌CV026紫色素的产生并抑制胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora引起的软腐作用[13]。部分微生物来源的QSIs结构如图3所示。微生物的多样性和次级代谢产物的复杂性为探索新型QSIs提供了有利的保障。

图3 微生物来源的QSIsFig.3 Part of QSIs from microorganisms

1.2 化学合成来源QSIs

化学合成的QSIs是对信号分子或者已知QSIs的结构修饰成得到的信号分子拮抗剂，或者是直接使信号分子失活的强氧化剂。其中信号分子拮抗剂占其中很大一部分。化学合成QSIs已经将目标锁定在AHL生物合成过程，AHL的结构修饰以及已知QSIs结构优化等方面。

1.2.1 阻断信号分子合成

（2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone，PQS）是铜绿假单胞菌的一种次级代谢产物，同时也是诱导lasB（编码LasB弹性蛋白）和RhlI表达的信号分子。Calfee M W等人发现PQS是邻氨基苯甲酸（anthranilate）与β-酮癸酸（β-keto-decanoic acid）缩合产生的次级代谢产物，见图4。使用甲基苯甲酸竞争性与β-酮癸酸反应后能有效抑制PQS生产，降低酶活，而不影响铜绿假单胞菌PAO1的生长[14]。这一类QSIs发掘跟QS系统的机理研究有关，其中信号分子生化过程的深入研究是关键。

图4 PQS的合成过程Fig.4 Synthesis process of PQS

1.2.2 修饰AHL结构

AHL通常由一个亲水性长度不等的酰基链和一个疏水性五元内酯环组成，这样的结构特点能使AHL通过氢键和疏水作用结合在活性位点上。修饰AHL酰基链和五元内酯环使QSIs与活性位点竞争性结合，从而阻断QS环路的进行。Reverchon S等人发现，AHL的酰基侧链上3位以羰基取代得到的化合物会产生不同程度的群体感应抑制活性。其中化合物HSL1（17）能抑制哈氏弧菌LuxR蛋白合成，其IC50值达到2μmol/L，化合物HSL 2～4（18-20）也表现出良好的群体感应抑制活性[15]。Yang Y X等人发现AHL类似物N-癸基-L-高丝氨酸苄酯（21）能有效抑制铜绿假单胞菌的LasI/LasR和RhI/RhlR系统，从而降低蛋白酶、弹性蛋白酶和鼠李糖的产生；还能抑制铜绿假单胞菌鞭毛运动能力；并与多种抗生素有协同治疗作用。该化合物是通过N-癸基-L-高丝氨酸与溴化甲苯酯化反应得到的。其群体感应抑制原理是N-癸基-L-高丝氨酸苄酯作为AHL的拮抗剂竞争LuxR受体蛋白靶标位点，阻断了QS信号通路[16]。O’Loughlin C T等人合成的一种类似铜绿假单胞菌信号分子3-oxo-C12-HSL小分子mBTL（22）具有部分抑制其绿脓素产生和生物体膜形成的能力。体内实验和体外实验结果均显示，mBTL能部分抑制LasR和RhlR的生物活性，并且在体内实验中RhlR为主要抑制对象。mBTL的群体感应抑制能力使其在抗菌药物开发方面富有潜力，将其运用于医疗设备和植入物可能具有防止细菌生物体膜形成的作用[17]。部分AHL修饰化合物见图5。

图5 部分AHL修饰化合物Fig.5 part of AHL modified compounds

1.2.3 已知QSIs类似物

Biswas N N等人利用4-bromo-5-（bromomethylene）-2（5H）-furanone与肼反应得到不同的溴代N-杂环。群体感应活性结果表明，合成的这一系列溴代N-杂环类化合物在250 mmol/L浓度下均能有效抑制铜绿假单胞菌MH602 LasR报告菌株中荧光蛋白的表达。其中化合物4-bromo-5-（（2-phenylhydrazinyl）methylene）furan-2（5H）-one（23）在该浓度下的荧光蛋白抑制率达到34%，5-（dibromomethyl）-3-ethyl-5-hydroxy-1-（p-tolylamino）-1H-pyrrol-2（5H）-one（24）的荧光蛋白抑制率达到33%。呋喃酮类化合物作为最先发现的QSIs，其结构修饰存在很大的发掘潜力[18]。Singh S等人以已知的QSIs双氯苯乙胍己烷（25）和氯苄烷铵盐（26）为原型进行不断修饰并辅助分子对接技术得到1-苄基-1-苯基双胍（27）和1-（4-氨基苯基）-1-苯基双胍（28）。N，N-二取代的双胍衍生物是由仲胺与氰基胍用微波照射技术在150℃下反应30 min后重结晶得到的，产率在38%到70%之间。同样作为AHL的拮抗剂，1-苄基-1-苯基双胍和1-（4-氨基苯基）-1-苯基双胍能有效抑制紫色杆菌ATCC12472的紫色素产生[19]。蓝藻中提取的化合物honaucin A-C能抑制哈氏弧菌BB120中生物荧光的产生，并且能抑制大鼠巨噬细胞RAWZ46-7中的先天免疫系统。Hyukjae C等人发现合成的honaucin A（29）类似物与天然化合物相比具有更强的群体感应抑制作用。其中4’位卤代对群体感应的抑制作用有很大的影响：氟取代降低抑制活性；溴取代增加抑制活性；碘取代后抑制能力与honaucin A相比提高了60倍（IC50= 1.3μmol/L），并且在32μmol/L浓度下不影响细菌的生长[20]。化学合成是基于一定的骨架基础上的化学修饰作用的结果，而通过其他来源的新型骨架的发现会加快化学合成QSIs发展的进程。部分已知QSIs类似物结构式见图6。

图6 部分QSIs类似物Fig.6 part of known QSIs analogues

2 当前QSIs的应用

QSIs的应用已经逐渐趋于多样化，包括水产感染疾病的治疗，污水治理和器械感染防治等方面。

（1）水产养殖方面的细菌感染问题是其发展的最大障碍。目前抗生素和消毒剂在水生动物疾病的预防和治疗方面收效甚微，而生物性农药的残留特别是亚治疗剂量的残留会加重致病菌的耐药性。QSIs可以阻断水生病原菌（哈氏弧菌等）的QS系统，抑制病原菌毒素的产生，最终达到治疗水产感染的目的[21]。

（2）治理污水是QSIs在环境方面应用的体现。膜生物反应器是一种污水处理的透过装置，在污水治理方面有可行的效果。但在使用过程中因为很多细菌依附于膜之上而形成生物淤积会大大降低了污水处理效率。胡椒提取物已被证实能通过抑制QS信号分子来减少膜生物淤积[22]。

（3）在临床器械感染方面，QSIs的应用也有体现。临床器械感染一直是使用生物材料植入物来拯救生命的一大难题。研究证明，使用QSIs二羟基吡咯酮表面固定化于临床器械能有效抑制器械表面97%的铜绿假单胞菌与沙雷氏菌粘附。绿色荧光蛋白的表达结果显示，医疗器械表面附着二羟基吡咯酮可在不影响铜绿假单胞菌生长的前提下抑制72%LasB-绿色荧光蛋白的表达。这说明医疗器械表面固定化二羟基吡咯酮能有效抑制铜绿假单胞菌的QS系统[23]。

3 结论与展望

作为新型抗感染药物的筛选模型，QSIs在缓解当前抗生素耐药性严重的现状中起着不可替代的作用。包括天然来源和化学合成等在内的革兰氏阴性菌QSIs来源在未来探寻新型QSIs中具有重要的借鉴作用。随着QS机理研究的不断深入，QSIs来源的多样化发展及QSIs的初步应用为其进一步发展提供了动力。但由于QSIs存在隐性的毒性无法将其进入运用阶段，因此，在进入临床研究前应对其毒性进行初步探索（如细胞毒性实验，小鼠感染模型实验等）可以快速筛选出具有潜力的QSIs。那些本身存在微量毒性QSIs可以通过结构修饰对其进行减毒处理，这样可以加快QSIs的临床研究进程。但是，由于研究时间或研究条件的限制致使这些后续实验未能展开。因此，QSIs的初步毒性探索会成为其进入实践应用的第一步，也是重要的一步。

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Albaugh公司新型种子处理杀虫剂产品ResonateTM600将于2017年春季上市

Albaugh公司近日宣布，将推出新型种子处理的杀虫剂产品ResonateTM600。该产品根据全新配方进行生产，能够减少种子处理过程中的粉尘，将于2017年春季上市。

（来源：http：//cn.agropages.com/News/NewsDetail——13067.htm）

Research Progress of Gram-negative Bacteria Quorum Sensing Inhibitors

WANG Hong1，PING Xia-ting1，CHEN Su1，PAN Qiu1，SHAO Yan-yan1，CHEN Xiao-chun1，LIYu-jin2
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310032，China；2.Shandong Marine Food Nutrition Research Institute，Rongcheng，Shandong 264309，China）

Quorum sensing is a cell-to-cell communication system based on their population density to mediate expression of target genes.Quorum sensing inhibitors can block expression of bacterial target virulence genes withouteffecting its growth.Thus quorum sensing inhibitors impose less selective pressure on microorganism to lessen antibiotic resistance pathogens.Because of this novel mechanism，quorum sensing inhibitors have potential in new anti-infective drugs screening.This paper briefly described study-best gramnegative bacteria quorum sensing system and source of quorum sensing inhibitors.We highlighted nature and chemicalsynthesis source ofquorum sensing inhibitors，as wellas some usages of quorum sensing inhibitors.

gram-negative bacteria;quorum sensing inhibitors;nature source;chemical synthesis

1006-4184（2016）11-0015-07

2016-04-08

国家自然科学基金资助项目（21337005），国家自然科学基金资助项目（30973681），浙江省自然科学基金资助项目（LY16H300008）。

王鸿（1972-），女，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士生导师，研究方向为药学。E-mail：hongw@zjut.edu.cn。