两种马铃薯干腐病镰刀菌的分离鉴定

王艳玲，张紊玮，杨麦娟，张琳苑

（1兰州理工大学生命科学与工程学院 甘肃 兰州 730050）（2甘肃农业大学食品科学与工程学院 甘肃 兰州 730070）

两种马铃薯干腐病镰刀菌的分离鉴定

王艳玲1，张紊玮2，杨麦娟1，张琳苑1

（1兰州理工大学生命科学与工程学院 甘肃 兰州 730050）（2甘肃农业大学食品科学与工程学院 甘肃 兰州 730070）

本文从甘肃定西地区采集患有干腐病的马铃薯块茎样品中，以组织分离及单孢纯化法分离到干腐病致病镰刀菌19株，根据形态学特征参照Nelson镰刀菌分类系统进行初步鉴定，并结合ITS序列测序鉴定为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）两个种，为今后有针对性地筛选有效杀菌剂防治马铃薯干腐病降低储藏期损失打下基础。

马铃薯干腐病；镰刀菌；ITS；菌种鉴定

马铃薯（Solonum tuberosum）是一种具有抗干旱、产量高、适应性强以及综合加工用途很广泛等优势的茄科作物[1]，已成为稻米、小麦、玉米之外又一主粮。马铃薯储藏过程中所面临一个严峻的问题——病害损失，然而最常见且最重要的一种储藏期病害就是镰刀菌干腐病[2,3]。国内外对马铃薯干腐病进行研究，报道的病原各有不同[4,5]。甘肃是我国马铃薯的主产区，产量和面积均居全国前列。但马铃薯块茎在储藏期间易发生腐烂，其中由镰刀菌引起的干腐病是造成马铃薯腐烂最主要病害。因此，调查马铃薯干腐病在定西地区的发生并鉴定致病菌，为今后筛选有效杀菌剂、评价马铃薯种质资源的抗病性、对有效防治马铃薯干腐病、降低储藏期损失都具有十分重要的意义。

1、材料和方法

1.1 患病马铃薯块茎样品的收集

2013年9月在甘肃省定西地区收集患病马铃薯块茎样品，并将其用多层保鲜膜包裹，最后用纸袋包装带回实验室。

1.2 致病菌的分离和鉴定

1.2.1 致病菌的分离和常规鉴定

自来水多次冲洗患病马铃薯块茎，70%乙醇消毒3-5m in后，再次用无菌水将病薯冲洗干净，然后用无菌刀片切取病变的马铃薯块茎和正常的马铃薯块茎交界处的染病组织，将其接种于PDA培养基（1000m l培养基配制；正常新鲜的马铃薯200g煮沸30m in,过滤弃渣，然后于滤液中加入葡萄糖20g和琼脂14g，煮沸，分装，121℃灭菌25m in）上，于26℃培养2d生长出菌落。然后采用划线法逐级分离单菌落。最后采用稀释法进一步进行单孢纯化。参照N elson分类系统，依照菌落颜色、形态、直径；孢子和菌丝体形态及大小等进行鉴定。

1.2.2 致病菌致病性的研究

选用健康且易染病的马铃薯，用75%酒精处理该马铃薯块茎的表皮，然后用0.5cm打孔器在该块茎上打孔，将PDA培养平板上的镰刀菌制成孢子悬浮液接种于马铃薯块茎内，空白对照接种无菌水。接种完成后用保鲜膜包裹该马铃薯，放置于干燥阴暗的地方培养，15d后观察发病情况。

1.2.3 病原菌的分子鉴定

镰刀菌的基因组采用CTAB法制备，采用镰刀菌rDNA保守ITS序列两端引物，上游引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ;下游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；PCR扩增条件：94℃5m in；94℃30s，56℃45S, 72℃80S, 35个循环72℃7m in，4℃30m in；PCR产物用Axyprep DNA 凝胶回收试剂盒纯化回收，送到北京天一辉远生物有限公司测序。用DNAM AN软件和GeneBank已知序列比对同源序列比对进行鉴定。

2、结果与分析

2.1 镰刀菌的分离纯化

采用病样分离培养及单孢分离纯化的方法从25个薯块分离中获得具有明显镰刀菌特征的菌株2株。分别将这两种菌株命名为F1和F2。菌株F1在PDA培养基上生长5天直径为48m m，气生菌丝呈羊毛状，较浓密，菌落颜色为乳白色，随着培养时间的加长菌落颜色变为灰白色；能够产生两种分生孢子：小孢子产生早而多；单生于小型瓶梗上，0-1个分隔，以卵圆形居多。大孢子产生于多分枝的分生孢子梗上，呈月牙状、微弯，较宽短；2-4个分隔，以3个分隔的占绝大多数（图1A）。菌株F2在PDA培养基上生长5d直径为54.5m m，气生菌丝呈绒毛状，稀疏，菌落颜色为淡粉色，随着培养时间加长菌落颜色加深呈粉红色。其产生的大型分生孢子通常3-5个隔膜。分生孢子座的产孢梗分枝或不分枝，单瓶梗。偶尔产生小型分生孢子，椭圆形，0-1个隔膜（图1B）。依据以上的菌株的培养特性和形态特征综合分析，初步鉴定F1为腐皮镰刀菌，F2为硫色镰刀菌。

图1 马铃薯干腐病病原菌F1，F2形态 A：F1菌株菌落、菌丝体及分生孢子的形态; B：F2菌株菌落形态、菌丝体及分生孢子的形态，F1, F2菌株均在PDA培养基上培养。

2.2 镰刀菌致病性分析

将PDA培养基上培养的镰刀菌菌丝制成菌饼接种于易感染的马铃薯块茎中，进行致病性分析。结果表明在接种15d后，接入菌的有白色菌丝从小孔，形成典型干腐病病斑，而接入无菌水的对照孔没有发生病变（图2）。

图2 镰刀菌的致病性 A，B：F1和F2菌株致病马铃薯表面和内部症状

2.3 镰刀菌分子鉴定分析

2.3.1 两种镰刀菌rDNA-ITS的PCR扩增

以两株镰刀菌总DN A 基因组为模板，用镰刀菌rDN A保守区设计引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测（图3A,B）。从图中可以看出扩增产物的大小和预计片段大小一致。然后进行扩增产物回收和纯化，并进行后续的测序。

图3 镰刀菌rDNA-ITS序列PCR扩增 A：F1菌株 B：F2菌株

2.3.2 rDNA-ITS 序列测定与分析

采用DNA-M AN软件对测序结果分析，结果表明获得的片段同镰刀菌的ITS1和ITS2及5. 8S在内的rDNA-ITS片段相同。采用GeneBank的Blast功能对2株镰刀菌rDNA-ITS的克隆片段进行序列比较和分析，结果表明：F1菌株的ITS序列与腐皮镰刀菌(Fusarium Solani) 相似度达到99%，F2菌株的ITS序列与硫色镰刀菌 (Fusarium sulphureum)相似度达到100%。F1、F2根据ITS 的分子鉴定结果，结合形态学鉴定，确定F1和F2分别为腐皮镰刀菌(Fusarium Solani)和硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)。

3、讨论和结论

不同国家和地区镰刀菌的种类和致病性存在着很大的差异，目前我国不同地区马铃薯干腐病的致病菌也各不相同。浙江省马铃薯干腐病主要致病菌为腐皮镰刀菌（茄病镰刀菌）、串珠镰刀菌、拟丝孢镰刀菌及其变种等[6]，河北省地区主要的致病菌是茄病镰刀菌和半裸镰刀菌[7]。本研究从甘肃省白银和定西地区分离到2种镰刀菌，通过常规的方法及分子鉴定分别为：腐皮镰刀菌和硫色镰刀菌。腐皮镰刀菌为全球分布相当广泛的一种镰刀菌属，一般从耕地、草原的土壤中均可以分离到，同时所耐受的温度范围也比较广[8,9]。硫色镰刀菌分布也较广泛，从农作物以及土壤中均能分离到。

[1] 徐坤，2002.马铃薯食品资源的开发利用.西昌农业高等专科学校学报,(2):47-51.

[2] Secor GA, 1999. Gudmestad NC. Managing fungal diseases of potato. Plant Pathology Journal, 21:213-221

[3] Leach SS,1985. Contamination of soil and transmission of seed-borne potato dry rot fungi ( Fusarium spp.) to progeny tubers. American Potato Journal, 62:129-136

[4] Hanson LE, Schwager S J,1996. Sensitivity to thiabendazole in Fusarium species associated with dry rot of potato . Journal of Phytopathology,1996,86:378-384．

[5] T heron DJ,1999.Fusarium dry rot of potatoes: etiology, epidemiology,toxicity and control,Bloemfontein: The University of the Orange Free State.

[6] 叶琪明，王拱辰，1994. 浙江马铃薯干腐病病原研究初报.植物病理学报，(25) : 148.

[7] 彭学文，朱杰华．2008. 河北省马铃薯真菌病害种类及分布．中国马铃薯，22(1) : 31-33．

[8] Burgess LW,Summerell BA,1992.Mycogeography of Fusarium: survey of Fusarium species from subtropical and semi-arid grassland soils from Queensl and Australia.Mycological R esearch, 96: 480-484.

[9] Sangalang AR，Burgess LW, Backhouse D，Murst M, 1995. Mycogeography of Fusarium species in soils from tropical arid and mediterranean regions of Australia．Mycological Research,99 (5) : 523-528.

甘肃省自然科学基金（N o: 148RJZA004）