温度和初始pH对植物乳杆菌LP1生长特性的影响

李雪雁 赵拓 任海伟 窦俊伟

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

温度和初始pH对植物乳杆菌LP1生长特性的影响

李雪雁 赵拓 任海伟 窦俊伟

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

从乳酸生成浓度、OD值和pH值等角度研究了从青贮秸秆中分离得到的植物乳杆菌LP1的生长特性。结果表明，植物乳杆菌LP1在pH值4.5～7.5可以生长且能产生一定量的乳酸，该菌株的最适宜生长温度为30-37℃，42℃培养亦可生长，有一定耐高温潜力。

植物乳杆菌; 温度; pH值; 生长特性

青贮是在厌氧条件下通过乳酸菌快速发酵产生乳酸，使pH迅速下降创造酸性环境，从而抑制梭菌等有害微生物生长、保存原料营养成分的过程。因此，青贮成功与否与乳酸菌有很大关系。青贮中常见的乳酸菌包括乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）等[1]。 其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、戊糖片球菌(Lactobacillus pentosaceus)等同型乳酸菌在发酵过程中起支配作用时，能更有效利用水溶性碳水化合物，pH下降更为迅速，伴随更少的干物质或能量的损失[2-3]。很多学者已将乳酸菌复合菌剂用作添加剂来提高青贮品质，因此选择生长性能好、产酸能力强的优良菌株尤为重要[4]。

本文以课题组分离筛选的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为研究对象，考察其在不同温度和初始pH条件下的生长情况，以期对青贮复合菌剂的开发提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是从玉米秸秆与白菜的混合青贮中分离得到，编号LP1。

1.1.2 基础培养基成分

MRS液体培养基：蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母浸膏5g；葡萄糖20g；吐温-80 1g；柠檬酸氢二氨2g；乙酸钠5g；硫酸镁0.1g；硫酸锰0.05g；磷酸氢二钾2g；加蒸馏水至1000 mL，配制固体培养基时加入琼脂15g[5]。

1.2 主要仪器与设备

智能生化培养箱（DHP-9082，上海一恒科学仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；SBA-40X生物传感分析仪(SBA-40C，山东省科学院生物研究所)。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的活化与纯化

将供试菌株接种于MRS液体培养基中，放入37℃培养箱中培养48h，待MRS液体培养基出现混浊取出。将活化的乳酸菌接种于MRS平板上反复划线分离，直到获得该菌的纯培养。

1.3.2 不同温度和初始pH生长试验

在20、30、37、42和50℃五个温度梯度和初始pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5六个pH梯度下，按1%（体积比）的接种量接种活化菌种于150 mL经严格灭菌处理的MRS液体培养基，于培养箱中厌氧培养48h，并动态分析培养液的OD值、乳酸浓度和pH值。

2、结果与分析

2.1 温度对植物乳杆菌的影响

由图1可知，植物乳杆菌在50℃时的OD值基本保持稳定不变，但在20℃、30℃和37℃条件下培养3h即进入对数生长期，6-33h后逐渐趋于平缓，到达生长稳定时期，33h后略微有所增加。42℃时培养的OD值增长速率低于20℃、30℃和37℃，对数生长期为3～12h，12h后该菌株生长速率放缓，进入稳定期。

图1 不同温度下植物乳杆菌中OD值的变化

图2 不同温度下植物乳杆菌中pH值的变化

图3 不同温度下植物乳杆菌乳酸浓度的变化

从pH值角度看（图2），pH值变化趋势与OD值变化相对应，二者呈负相关，20℃、30℃、37℃时的pH值变化趋势基本相同，且这三种温度时的发酵液pH值下降速率较42℃时迅速，与图1一致。50℃培养时pH值恒定，但36h后有所下降，这可能是生成的少量乳酸累积所致。

由图3产乳酸情况可知，4 2℃时的产酸速率较快，且乳酸浓度在1120～1420mg/mL范围内平稳增加，始终高于其余温度条件；30℃时的产酸速率与42℃相近，但乳酸浓度略低于42℃；37℃时乳酸生成速率略低于30℃和42℃，但21h后也达到1000～1160mg/ mL浓度范围，与30℃时接近。20℃培养时，乳酸浓度在初始阶段的3～9h迅速增加，但9h后迅速下降至480mg/mL的较低值，21h后乳酸浓度恒定且略有上升，说明20℃不利于乳酸的生成积累。50℃时的乳酸浓度很低，这与图1中较低OD值相一致，判定该菌株在50℃时不生长。

2.2 初始pH值对植物乳杆菌影响

由图4可知，初始pH值7.5时，对数生长期为3～6h，之后进入稳定生长期；随着初始pH的下降，乳酸菌生长速率受到负面影响，对数生长期时间推迟。当菌株在初始pH值为3.5和8.5的强酸、碱环境中培养时，OD值始终处于较低水平。

由图5可知，不同初始pH值培养的乳酸菌在繁殖过程中由于乳酸积累均会使pH值发生下降现象，培养21h后pH值不再变化；但值得注意的是，调节好pH值得培养基经灭菌后均有所下降，这可能是高温灭菌所致。另一方面，偏碱性的培养环境下pH值下降速度较快，酸性环境下培养的pH值基本保持不变。

由图6可知，菌株1在pH值4.5以上均能产生一定量的乳酸，其中pH值5.5时生成的乳酸浓度最高，随着pH值得升高，乳酸浓度有所降低。该菌株在pH值3.5培养时，乳酸含量一直很低，可以判定植物乳杆菌在pH为3.5时不生长。进一步分析发现，该菌株的乳酸累积爆发期在12h之后，21h后乳酸浓度大幅增加且趋于稳定。

3、结 论

植物乳杆菌LP1受温度和pH值等环境因素影响较大。在42℃培养时生长繁殖略微缓慢，但乳酸生成浓度较高，在30℃和37℃培养时生长速率最快，但产酸量略低于42℃，说明菌株1具有一定的耐高温性，可以作为42℃时青贮用乳酸添加剂。植物乳杆菌LP1在pH值3.5和8.5环境中不生长，pH值5.5、6.5和7.5条件下产酸稳定且浓度较高。

图4 不同初始pH条件下植物乳杆菌OD值的变化

图5 不同初始pH下植物乳杆菌中pH的变化

图6 不同初始pH下植物乳杆菌乳酸浓度的变化

［1］Queiroz O C, Adesogan A T, Arriola K G, et al. Effect of a dualpurpose inoculant on the quality and nutrient losses from corn silage produced in farm-scale silos[J].Journal of Dairy Science,2012,95(6):3354-3362.

［2］（澳）凯泽. 顶级刍秣：成功的青贮[M].北京:中国农业出版社,2008.

［3］Pang Huili, Zhang Meng, Qin Guangyong, et al. Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers[J]. Animal Science Journal, 2011, 82(5):642-653.

［4］刘晶晶,高丽娟,师建芳,王小芬,袁旭峰,崔宗均.乳酸菌复合系和植物乳杆菌提高柳枝稷青贮效果[J].农业工程学报,2015,31(9):295-302.

［5］郭兴华,凌代文.乳酸细菌现代研究实验技术[M].北京：科学出版社,2013.