食品中沙门氏菌检测方法比较

2016-12-19王歆睿

中国食品工业 2016年1期

关键词：国标菌液沙门氏菌

王歆睿姜薇

(辽宁省分析科学研究院辽宁沈阳)

食品中沙门氏菌检测方法比较

王歆睿姜薇

(辽宁省分析科学研究院辽宁沈阳)

本文运用国标微生物培养方法和PCR法对多个人工污染食品样本进行检测，从准确性、灵敏度、检测成本和检测周期几方面对检测方法进行比较。PCR技术具有敏感高、检测周期短等优点,同时PCR技术检测成本高，不适合大批样品的检测。

沙门氏菌检测 PCR 食品

前言

沙门氏菌属是肠杆菌科中最重要的一个属[1]。它是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌[2]，引起急性胃肠炎和伤寒等烈性传染病，对食品安全构成了严重威胁，国家不断加强对食品中致病菌的监管，因此对食品中沙门氏菌检测技术的研究十分关键。沙门氏菌的检测一般有传统的培养技术，免疫学技术和PCR检测技术三个方法[3]。传统微生物培养技术是将样本经过预增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定血清学鉴定与分群四个步骤，做出鉴定。一般需要4~7天，才能得出明确的结果[4]。PCR法检测食品中沙门氏菌是利用游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），以目标基因组DNA上正、反相两引物间的某一区段为模板进行快速扩增，电泳观察结果[5]，可以在12小时内快速检测沙门菌。本文分别用国标方法和PCR方法对多个样本进行检测，从准确性和灵敏度两方面对这两种检测方法进行比较。

1、材料和方法

1.1.实验材料

1.1.1 样品

鸡蛋15份，各养鸡场送检；配合饲料10份，饲料公司送检；牛奶 8份，购于超市。

1.1.2

沙门氏菌标准菌株

1.1.3 试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）实验室自制；四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液，亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液；亚硫酸铋（BS）琼脂，沙门氏菌显色培养基，沙门氏菌生化鉴定盒，沙门氏菌O和H诊断血清，均购于广东环凯微生物科技有限公司。沙门氏菌核酸扩增检测试剂盒，购于北京索奥生物技术有限公司。引物：引物序列为P1:5’-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3’,P2:5’-AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3’。

1.2 仪器设备

ABI 2720型 PCR仪、全自动高压灭菌器、Dynamica DNA master核酸蛋白分析仪、恒温培养箱、WEALTEC凝胶成像系统。

1.3 国标微生物培养方法

1.3.1 沙门氏菌标准菌株复苏后制成菌悬液,菌悬液浓度1.0×104 CFU/mL，依次稀释菌悬液浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0 CFU/mL。吸取各浓度菌悬液1mL污染样品。

1.3.2 前增菌：称取样品25g放入无菌均质袋中，加入225mL缓冲蛋白胨水（BPW）用均质器拍打50秒，置于培养箱内36℃培养18小时。

1.3.3 增菌移取1mL前增菌液，分别接种于10mL四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液和10mL亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液内，分别置于不同培养箱中42℃（TTB）36℃（SC）培养24小时。

1.3.4 分离培养：分别用接种环取增菌液1环，划线接种于沙门氏菌显色培养基。

36℃培养24小时，观察平板上菌落生长情况。在沙门氏菌显色培养基平板上典型沙门氏可疑菌落呈现光滑、略凸起，直径1~3mm，边缘整齐的品红菌落。

1.3.5 生化鉴定：将可疑菌落用0.85%无菌生理盐水稀释至109 CFU /mL,吸取一到两滴菌悬液接种到各西林瓶内，在培养箱中36℃培养24小时后观察反应情况。

1.3.7 血清型鉴定按照沙门氏菌诊断血清操作说明书进行反应。A-F型多价血清菌体试验结果分类：阳性反应，混合物试验凝集，而在盐水对照中不凝集。阴性反应, 混合物试验不凝集，而在盐水对照中也不凝集。

1.4 PCR检测方法

1.4.1 样品DNA的提取：将增菌液用12000r/min离心3min，收集沙门氏菌菌体，倒去上清液，灭菌生理盐水洗涤2次，用灭菌去离子水悬浮，隔水煮沸15min，12000r/min离心3min，取上清液作为DNA模板溶液。

1.4.2 PCR反应体系：反应体系（25μ L）含10×PCR Taq酶缓冲液2.5μ L，引物（10ol/L）1μ L，dNTP（2.5 mmol/L）1μ L，MgCl2（25 mmol/L）1.5μ L，Taq DNA合酶（1 U/μ L，）1μ L，DNA模板5μ L，灭菌双蒸水13μ L。

PCR循环参数：94℃预变性3 min；接着作35个循环，每个循环包括94℃变

性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；循环结束后72℃延伸10 min。

1.4.3 电泳检测：取5μ L PCR扩增产物与1μ L上样缓冲液混匀，分别点样于2%琼脂糖凝的点样孔中，以100bp DNALadder为分子量标准，70 V电压电泳1 h，经EB染色后，用凝胶成像仪成像并观察结果。

2、结果与分析

2.1 样品检测结果

共33份样品，用浓度为10.0CFU/mL沙门氏标准菌株菌悬液人工污染样品，分别用微生物培养和PCR法检测，结果如表1所示。

表1 人工污染菌样品微生物培养和PCR检测结果（菌液浓度10.0 CFU/mL）

微生物培养法阳性检出率为100%，PCR法样品的阳性检出率也可以达到100%。

经人工污染的5份无菌牛奶样品，菌悬液浓度分别为0、1.0、2.0、5.0、10.0 CFU/mL，国标微生物培养法检测结果，菌悬液浓度1.0 CFU/mL的污染样品结果为阴性，其他浓度为阳性。PCR法检测结果，5份污染样品均为阳性。

3、讨论

对人工污染的33份鸡蛋、饲料和牛奶样品，分别用国标微生物培养法和PCR法检测沙门氏菌，阳性检出率均达到100 %，说明这两种方法检测的准确度都较高。国标微生物培养法样品中活菌的检测限为2.0CFU/25g，PCR法样品中活菌的检测限为1.0 CFU/25g，PCR法与国标微生物培养法比较具有更高灵敏度。