丁基苯酞对帕金森模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数及TH、TNF-α蛋白表达的影响

耿海威， 马丽丽， 王欲立， 杨 洋， 王占友， 聂莹雪



丁基苯酞对帕金森模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数及TH、TNF-α蛋白表达的影响

耿海威1， 马丽丽1， 王欲立2， 杨 洋2， 王占友3， 聂莹雪4

目的 研究丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide，NBP)对由MPTP诱导的C57BL/6小鼠帕金森模型中脑黑质多巴胺能神经元数及TH、TNF-α蛋白表达的影响，进一步探讨其保护机制。方法 24只C57BL/6小鼠，随机分成3组：正常对照组，MPTP组，NBP治疗组。MPTP腹腔注射法制备帕金森模型，免疫组织化学法观察中脑黑质TH阳性神经元细胞数，蛋白质印迹法观察中脑黑质TH、TNF-α蛋白含量的变化。结果 (1)与正常对照组比较，MPTP组可见帕金森病小鼠中脑黑质TH阳性神经元明显减少(P<0.01)；与MPTP组比较，NBP治疗组帕金森病小鼠中脑黑质TH阳性神经元数目明显增加(P<0.01)；(2)与正常对照组比较，MPTP组帕金森病模型小鼠中脑黑质TH蛋白表达减少(P<0.01)，而TNF-α蛋白表达增加(P<0.05)；(3)与MPTP组比较，NBP治疗组帕金森病模型小鼠中脑黑质TH蛋白表达明显增加(P<0.01)，而TNF-α蛋白表达减少(P<0.05)。结论 丁基苯酞可能通过提高中脑黑质中TH的含量及减少TNF-α炎性介质表达发挥对MPTP所致C57BL/6小鼠帕金森模型的神经元保护作用。

丁基苯酞； MPTP； TH； TNF-α

帕金森病(Parkinson disease，PD)为中老年人常见的神经系统变性疾病，其病理基础是以中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元大量变性、纹状体多巴胺递质含量显著减少为特征，其纹状体多巴胺递质含量的降低程度与多巴胺能神经元数目的减少程度相一致[1，2]。近年来，一直试图寻找有效的神经保护药物，以阻止神经元变性和疾病进展。丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)可有效阻断缺血性脑卒中的多个病理环节发挥神经保护治疗，在氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等发病机制方面与帕金森病有共通点，目前尚缺乏丁基苯酞抑制炎症反应发挥对帕金森病神经保护的文献报道[3，4]。本实验主要通过研究丁基苯酞对MPTP诱导的C57BL/6帕金森模型小鼠黑质多巴胺能神经元数量及TH、TNF-α的蛋白表达的影响，进一步探讨丁基苯酞对帕金森多巴胺能神经元的炎性保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组 24只C57BL/6 小鼠随机分为3组，每组各8只。(1)正常对照组(NS+植物油)：腹腔注射与MPTP组等体积生理盐水5 d，再注射与治疗组等体积植物油14 d；(2)MPTP组(MPTP+植物油)：MPTP( 30 mg/kg) 连续5 d腹腔注射，然后改用生理盐水注射14 d；(3)治疗组( NBP+MPTP)：MPTP( 30 mg/kg) 连续腹腔注射5 d，然后NBP(40 mg/kg)腹腔注射14 d(NBP由石药集团恩必普药业有限公司提供，植物油溶解后使用)。

1.2 帕金森动物模型的制备 月龄C57BL/6小鼠24只，体重20～30g，MPTP( 40 mg/kg) 连续腹腔注射5 d，间隔24 h。注射药物后小鼠即刻出现步态蹒跚，易激惹，毛及鼠尾竖起，抓鼻，全身抽搐等反应，约5～10 min 后恢复常态，即视为模型制备成功。

1.3 免疫组织化学染色标本制备 每组动物于19 d处死后取脑组织进行固定石蜡包埋，取中脑黑质部位切片进行免疫组化染色。(1)烘片( 60～65 ℃) 4 h，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，0.01 mmol /L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，5 min /次，新鲜配制的 3%过氧化氢室温下反应 10 min，0.01 mmol /L磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，5 min/次，微波修复(柠檬酸缓冲液)，高火3.5～4 min，使其快速达到95 ℃，然后自然冷却至室温。0.01 mmol /L磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，5 min/次，5%羊血清37 ℃封闭1 h，去掉多余羊血清后加入兔抗小鼠 TH 抗体(1∶200)、GFAP 抗体(1∶1000)，4 ℃过夜，37 ℃复温1 h，0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，5 min /次，加入生物素化羊抗兔、抗鼠IgG(1∶50)，置 37 ℃室温下反应1 h，辣根过氧化物酶(HRP)标记的ABC复合物于37 ℃室温下反应1 h，0.01 mmo/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，5 min /次，DAB显色，室温下反应 5～10 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。(2)阳性结果判定：根据实验过程中 DAB 被辣根过氧化物酶氧化后呈现棕黄色的原理，进行阳性结果判定，免疫组织化学染色阳性细胞呈棕黄色。对每张切片中脑黑质特定高倍视野下全部阳性细胞进行计数。

1.4 蛋白质印迹技术检测 将分离的黑质组织按比例加入裂解液(1 mmol/L Tris，50 mmol/L氯化钠，0.03 μmol/L焦磷酸钠，50 mmol/L氟化钠，1% Triton X-100，1 mmol/L苯甲基-磺酰氟，1 mmol/L钒酸钠，20 μg/ml抑肽酶)制成 50 mg/ml匀浆液，15000 r /min、4 ℃离心15 min，上清液80 ℃保存，采用二辛可宁酸( bicinchoninic acid，BCA)法测定裂解液中的总蛋白质含量；组织匀浆中加入2×样品缓冲液对半稀释，煮沸 5 min，6000 r/min 离心3 min，取上清液上样，取30 μg样品进行10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，分离蛋白质；转膜后室温下封闭2 h，加入一抗，置4 ℃过夜，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、抗鼠IgG(1∶1000，美国sigma公司)于室温下孵育1 h，采用增强型化学发光显色系统(美国 sigma公司)显示蛋白条带，感光在胶片上。

2 结 果

2.1 中脑黑质TH免疫组织化学结果 正常对照组中脑黑质TH阳性神经元排列整齐，形态正常，呈条带状；MPTP组与正常对照组比较TH阳性神经元数目减少，稀疏、散在，差异有统计学意义(P<0.01)；NBP组与MPTP组比较TH阳性神经元数目增多，细胞排列较整齐，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 中脑黑质TH阳性细胞数量变化

*P<0.05，**P<0.01

图1 中脑黑质TH阳性神经元形态变化(×40倍)

图2 中脑黑质TH蛋白表达的变化

图3 中脑黑质蛋TNF-α蛋白表达的变化

2.2 中脑黑质TH蛋白表达的变化 MPTP组中脑黑质TH蛋白表达较正常对照组降低明显，二者有统计学差异(P<0.01)；NBP组与MPTP组比较中脑黑质TH蛋白含量明显升高，二者有统计学差异(P<0.01)。

2.3 中脑黑质蛋TNF-α蛋白表达的变化 MPTP组中脑黑质TNF-α蛋白表达较正常对照组明显升高，二者有统计学差异(P<0.05)；NBP组与MPTP组比较中脑黑质中TNF-α蛋白表达降低，二者有统计学差异(P<0.05)。

3 讨 论

帕金森病( Parkinson disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，临床以静止性震颤、肌强直、运动迟缓等为主要表现，发病机制除与多种遗传基因突变及环境毒素有关外，氧化应激、线粒体功能障碍、神经营养因子缺乏、钙超载、细胞凋亡等均可能参与其发病机制形成。当前抗帕金森药物治疗主要以延缓其病情进展为主，目前尚没有任何一种药物可有效阻止其进展，考虑多种机制共同参与，因此多靶点协同治疗可能有效[5]。在本实验中，丁基苯酞对MPTP所致帕金森小鼠模型有神经保护作用，主要通过提高中脑黑质中酪氨酸羟化酶的含量及下调TNF-α的表达起作用。

帕金森病的病理改变主要是黑质致密部多巴胺能神经元变性、缺失为主要表现，脑内多巴胺含量下降至一定程度时可出现临床症状，而酪氨酸羟化酶是中脑黑质多巴胺合成的重要限速酶，酪氨酸羟化酶的变化与脑内多巴胺变化呈正相关[6]。本实验中，MPTP组黑质多巴胺能神经元数量较正常对照组明显下降，且TH蛋白表达降低更明显，二者有统计学差异(P<0.01)；NBP组与MPTP组比较黑质中多巴胺能阳性神经元数量及酪氨酸羟化酶的蛋白含量明显升高，二者有统计学差异(P<0.01)；因此，丁基苯酞可能通过增加黑质中酪氨酸羟化酶的表达而增加多巴胺含量对帕金森病起保护作用。

帕金森病中脑黑质中小胶质细胞含量相对较为集中，活化的小胶质细胞可分泌多种细胞因子，如TNF-α和IL-1等，这些细胞因子参与多巴胺能神经元的变性死亡，同时参与到帕金森病发生、发展的各个阶段，而TNF-α在中枢神经系统中主要由小胶质细胞和星形胶质细胞产生，在帕金森病炎性机制的研究较多，是一种在文献中得到证实的前炎症因子[7，8]。本实验中，MPTP组中脑黑质TNF-α蛋白表达较正常对照组明显升高，二者有统计学差异(P<0.05)；NBP组与MPTP组比较中脑黑质中TNF-α蛋白表达降低，二者有统计学差异(P<0.05)；因此，丁基苯酞可能通过降低中脑黑质中TNF-α蛋白表达，减轻其炎症反应，从而发挥其对帕金森病保护作用。

综上所述，丁基苯酞可能通过提高中脑黑质中酪氨酸羟化酶含量及抑制小胶质细胞炎性介质的表达发挥对MPTP诱导C57BL/6小鼠帕金森模型的神经元保护作用。因此，丁基苯酞对中枢神经系统变性疾病，如帕金森病等有潜在的应用价值，但对其发病机制的研究有待于进一步探讨。

[1]Jiang J，Kim JJ，Kim DY，et al. Acorusgramineus inhibits microglia mediated neuroinflammation and prevents neurotoxicity in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced mouse model of Parkinson’s disease[J]. Ethnopharmacol，2012，144(3)：506-513.

[2]Gaven F，Marin R，Claeysen S. Primary culture of mouse dopaminergic neurons[J]. Visualized Experiments，2014(91)：e51751-e51751.

[3] Li L，Zhang B，Tao Y，et al. DL-3-n-butylphthalide protects endothelial cells against oxidative/nitrosative stress，mitochondrial damage and subsequent cell death after oxygen glucose deprivation in vitro[J]. Brain Res，2009(1290)：91-101.

[4]Rekha KR，Selvakumar GP. Gene expression regulation of Bcl2，Bax and cytochrome-C by geraniol on chronic MPTP/probenecid induced C57BL/6 mice model of Parkinson’s disease[J]. Chem Biol Interactions，2014，217：57-66.

[5]Huang JZ，Chen YZ，Su M，et al. DL-3-n-Butylphthalide prevents oxidative damage and reduces mitochondrial dysfunction in an MPP+-induced cellular model of Parkinson’s[J]. Neurosci Let，2010，475(2)：89-94.

[6]Huang DY，Ye M. Microglia and Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16(24)：4549-4554.

[7]Tsai SJ，Kuo WW，Liu WH，et al. Antioxidative and anti-inflammatory protection from carnosine in the striatum of MPTP-treated mice[J]. Agricultural & Food Chemistry，2010，58(21)：11510-11516.

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The Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease

GENG Haiwei，MA Lili，YANG yang，et al.

(The Center Hospital of Kaifeng，Kaifeng 475000，China)

Objective To detect the Effect of dl-3n-Butylphthalide on the substantia nigra of midbrain dopaminergic neurons and the protein expression of TH and TNF-α in the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice，to investigate the protection mechanism. Methods The twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group(NOR)，MPTP group and NBP group. To prepare Parkinson’s disease model through intraperitoneal injection of MPTP. The TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain were observed by immunohistochemical method，the protein expression of TH and TNF-α in the substantia nigra of midbrain were observed by Western blot. Results (1)Compared with the normal group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)；Compared with the MPTP group，The the TH positive neurons cells in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)；(2)Compared with the normal group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly decreased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly increased(P<0.05)；Compared with the MPTP group，the protein expression of TH in the substantia nigra of midbrain was markedly increased(P<0.01)，the protein expression of TNF-α was significantly decreased(P<0.05)；Conclusion dl-3n-Butylphthalide might play a neuroprotective role on the MPTP model of Parkinson’s disease in C57BL/6 mice through increase the content of TH in the substantia nigra of midbrain and reduce the TNF-α expression of inflammatory mediators.

Dl-3n-butylphthalide； MPTP； TH； TNF-α

1003-2754(2016)03-0245-03

2015-11-12；

2015-12-28

(1.开封市中心医院神经内科，河南 开封 475000；2.中国医科大学第一附属医院神经内科，辽宁 沈阳 110001；3.中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，辽宁 沈阳 110001；4.中国医科大学第一附属医院神经内科，辽宁 沈阳 110001)

聂莹雪，E-mail：nieyingsnow@163.com

R742.5

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