欧芹根总黄酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠的治疗作用及机制研究*

谢婧雯，陈　妍，贾蔓菁，朱曼丽，雷林杰

（1.新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐　830063；　2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐　830011）

欧芹根总黄酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠的治疗作用及机制研究*

谢婧雯1，陈妍1，贾蔓菁1，朱曼丽2，雷林杰1

（1.新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐830063；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐830011）

目的 探讨欧芹根总黄酮对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠模型的影响机制。方法 采用高脂饮食诱导NAFLD大鼠40例建模，随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组和欧芹根总黄酮组，各10只，分别给予生理盐水、生理盐水、水飞蓟素、欧芹根提取物，除正常组外，其他组均每日喂食高脂饲料。检测各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR）法检测肝组织中环氧合酶-2（COX-2）的mRNA表达水平。结果 建模成功，模型组大鼠血清ALT，AST，TC，TG水平与正常组大鼠相比均明显升高（P＜0.05）；水飞蓟素和欧芹根总黄酮干预后能显著降低NAFLD大鼠上述4项指标水平，并抑制COX-2的mRNA表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）；欧芹根总黄酮作用略强于水飞蓟素，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 欧芹根总黄酮对NAFLD大鼠有一定的治疗作用，其作用机制与抑制肝组织中COX-2的表达有关。

欧芹根总黄酮；非酒精性脂肪性肝病；环氧合酶-2

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精及其他明确的肝损伤因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征［1-2］，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化4个从轻到重的病理阶段［3］。该病发病机制较复杂，且至今尚不完全清楚。其治疗以西药为主，以起到保护肝细胞、调节血脂及血糖等作用，但安全性有待进一步验证［4］。与此同时，天然药物以其作用温和、毒副作用相对较小的优势逐渐受到关注。新疆维药芹菜根为伞形科植物欧芹 Petroselinum crispum（Mill）Hill的干燥根［5］（与我们平时食用芹菜的根部不同），当地用其治疗肝脏疾病。目前，除笔者前期所作研究外，关于该药物活性成分和药理机制的研究报道较少。因此，对该药进行系统地研究十分必要。

1　材料与方法

1.1动物、仪器与试药

1.1.1动物

SD大鼠40只，购自上海实验动物中心，动物合格证号为SYXK＜沪＞2013-0034。体质量（180±20）g，自由饮食，饲养温度条件为（22±2）℃。

1.1.2仪器

LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；东胜EDC-810型基因扩增仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；ABM基因梯度扩增仪（Applied Biosystems公司）；HITACHI CF 15R型高速冷冻离心机（Sigma公司）；VILBER LOURMAT vo3 7742型凝胶成像系统（Vilber Lourmat公司）；DK-S12型和DK-S16型电热恒温水浴锅（常州润华电器公司）；UV-1800型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；DYY-4C型电泳仪（美国Biorad公司）；Q／FY-LYY002型电泳槽（上海天能科技有限公司）；SHELLAB S16-2型摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）等。

1.1.3试药

水飞蓟素（天津天士力圣特制药有限公司，批号为201302090021）；欧芹根购自新疆乌鲁木齐市二道桥市场洛克曼维吾尔医药行，经新疆维吾尔自治区药物研究所张彦福教授鉴定为伞形科植物欧芹 Petroselinum crispum（Mill）Hill的干燥根。欧芹根总黄酮采用6倍量70%乙醇提取欧芹根粗粉，提取2次，每次1 h，合并2次的滤液，旋转蒸发后，将提取物用蒸馏水溶解后通过聚酰胺柱，收集流出液，浓缩干燥后即得。总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）检测试剂盒（南京建成生物工程公司）；RNA提取试剂盒（乌鲁木齐欧易生物科技有限公司）；逆转录酶为实时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）的鼠白血病逆转录酶（M-MLV）第一链合成酶（Invitrogen公司，货号为C28025-032）；实时荧光染料为SYBR Select Master Mix（ABI公司，货号为4472920）。1.2大鼠NAFLD模型建立

取花生油50 g，加热，加入胆固醇15 g融化，搅匀后加入吐温80 3.5 mL，制成油相；使用水50 mL、全脂奶粉10 g、食盐1 g、蔗糖20 g和丙二醇3.5 mL加热后加入脱氧胆酸钠1 g，制成水相；随后将油相和水相充分混合为高脂乳剂，根据大鼠体重每周喂食2次，平时以高脂饲料维持，连续喂食12周。将40只大鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组和欧芹根总黄酮组，各10只。正常组和模型组腹腔注射相同体积比例的生理盐水，水飞蓟素组腹腔注射水飞蓟素（每100 g体质量10 mg）、欧芹根总黄酮组腹腔注射欧芹根提取物（每100 g体质量10 mg），每5天给药1次。除正常组外，其他组均每日喂食高脂饲料。4组大鼠喂食12周后用检测试剂盒测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、TC及TG水平。同时，麻醉大鼠后取其肝组织提取RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA进行qRT-PCR。

1.3荧光定量PCR试验方法

采用 DanoDrop1000鉴定总 RNA的纯度，以RNase-water对照液，DanoDrop1000测定总 RNA在260，280 nm波长处的吸光度，得到总RNA的浓度及OD260／OD280值（1.8＜OD260／OD280＜2.0）。取总 RNA和6×loading buffer电泳经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪照像，检测总RNA的纯度与完整性。完整的RNA应是2条亮带即2个主要的核糖体：18sRNA（相对分子质量约为2.1 kb）和28sRNA（相对分子质量约为4.5 kb）可作为相对分子质量参照。质检合格的RNA样本，使用qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统得到cDNA，使用ABI公司的ABI7500荧光定量PCR系统二步法进行。目的基因COX2和内参基因β-Actin的引物序列见表1［6-7］。

表1　实时荧光定量PCR引物序列

1.4统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料以X±s表示，行 t检验；计数资料以百分率表示，行 χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1对NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影响

NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平均显著高于正常组（P＜0.05）；水飞蓟素和欧芹根总黄酮均可明显降低NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平（P＜0.05），且后者的效果略优于前者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2　各组NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平比较（X±s，U／L，n=10）

2.2对NAFLD大鼠血清TC和TG水平的影响

NAFLD大鼠血清中TC和TG水平均显著高于正常组（P＜0.05）；水飞蓟素和欧芹根总黄酮可明显降低NAFLD大鼠血清中TC和TG水平（P＜0.05），且后者效果略优于前者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

2.3对NAFLD大鼠COX-2基因水平表达的影响

所有肝组织的RNA逆转录为cDNA后使用普通PCR手段进行琼脂糖电泳分析，发现均能扩增出目的基因COX2和内参基因β-Actin，可用于后续试验。试验结果见图1。

目的基因COX-2和内参基因β-Actin的溶解曲线均符合试验需要，扩增斜率均接近-3.34，可用于后续试验。见图2。

表3　各组NAFLD大鼠血清中TC和TG水平比较（X±s，mmol／L，n=10）

图1　基因片段电泳图

图2　基因溶解曲线图

将4组大鼠的cDNA行qRT-PCR试验，结果欧芹根总黄酮及水飞蓟素均可有效抑制COX2的表达，且前者抑制效果略好。见图3。

图3　不同组别COX-2相对表达量

3　讨论

近年来，NAFLD发病率有明显增加趋势，已成为目前最常见的肝脏疾病［8］。营养过剩所致的体质量增长过快、过重、肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征相关脂肪性肝病，以及隐源性脂肪性肝病均属于原发性非酒精性脂肪性肝病范畴，主要表现为TC，TG，AST，ALT水平升高等。NAFLD较严重患者可出现肝纤维化，主要表现为AST／ALT升高等［9］。因此，本研究中采用长期高脂肪、高胆固醇饲料喂养诱发大鼠NAFLD形成，此模型发病病因及病症等均更加接近临床NAFLD病症，同时也是目前国内常用NAFLD模型［10］。通过检测TC，TG，AST，ALT水平以研究欧芹根总黄酮对NAFLD的调脂、抗纤维化等作用。

此外，国内外文献也报道了COX-2的表达对NAFLD的影响。赵锦燕等［11］的研究通过检测血清中ALT和AST水平变化，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法和免疫组化法检测COX-2基因和蛋白表达发现，抗氧化能力的提高有利于治疗NAFLD。王雯等［12］的试验结果表明，大鼠NAFLD的治疗作用机制可能与抑制肝组织中COX-2的表达及活性有关。此外，唐彬等［13］研究发现，抑制COX-2的mRNA转录和蛋白表达对高脂-脂肪肝大鼠疗效明显。因此，本研究中采用qRTPCR法测定COX-2 mRNA在肝组织中的表达，以此研究欧芹根总黄酮对NAFLD的抗氧化机制作用。

新疆维药芹菜与我们平时食用的芹菜不同，主要为水芹和旱芹，广泛分布于全国各地［14］。由于特殊的地理环境，欧芹根较水芹根粗，较旱芹根细，主要分布于新疆和田、阿克苏一带。维医认为，芹菜根有活血化瘀、健脑安神、祛风除湿等功效，但对其活性成分及药理机制未见详细报道［15］。因此，有必要对欧芹根总黄酮进行深入研究和探讨。

本研究结果表明，欧芹根总黄酮干预NAFLD模型大鼠，可显著降低其TC，TG，AST，ALT水平，明显改善其肝功能。同时，其肝组织中COX-2 mRNA表达降低，表明欧芹根总黄酮对NAFLD的作用机制可能通过抑制COX-2的表达实现。

［1］李瑜元.非酒精性脂肪性肝病的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2013，21（2）：109-115.

［2］李娟，叶菲.非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究进展［J］.国际药学研究杂志，2011，38（5）：341-344.

［3］汪春燕，郭传勇.非酒精性脂肪肝的研究新进展［J］.保健医学研究与实践，2011，8（1）：68-73.

［4］颜红梅，高鑫，刘蒙，等.非酒精性脂肪肝与代谢综合征关系的研究［J］.中国糖尿病杂志，2006，14（5）：326-328.

［5］刘飞，陈妍，林伊梅，等.维药芹菜根提取物对高脂血症大鼠血脂的调节作用［J］.新疆中医药，2011，29（5）：52-54.

［6］王雯，李俊，李荣，等.橙皮苷对非酒精性脂肪肝大鼠

COX-2表达及活性的影响［J］.中国药理通讯，2011，28（2）：72.

［7］Tsuzaki M，Guyton G，Garrett W，et al.IL-1β induces COX2，MMP-1，-3 and-13，ADAMTS-4，IL-1β and IL-6 in human tendon cells［J］.Journal of Orthopaedic Research，2003，21（2）：256-264.

［8］张巍.高脂诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病的发病机制和治疗的实验研究［D］.武汉：武汉大学，2014.

［9］常彬霞，滕光菊，邹正升，等.非酒精性脂肪性肝病的研究进展［J］.传染病信息，2011，24（5）：309-313.

［10］Chen N，Bezzina R，Hinch E，et al.Green tea，black tea，and epigallocatechin modify body composition，improve glucose tolerance，and differentially alter metabolic gene expression in rats fed a high-fatdiet［J］.NutritionResearch，2009，29（11）：784-793.

［11］赵锦燕，郑玉清，洪振丰，等.粗叶悬钩子总生物碱对非酒精性脂肪肝的抗氧化作用［J］.福建中医学大学学报，2011，21（5）：15-17.

［12］王雯，李俊，李荣，等.橙皮苷对非酒精性脂肪肝大鼠COX-2表达及活性的影响［J］.安徽医科大学学报，2011，46（9）：897-899.

［13］唐彬，艾正琳，姚树坤.苦参碱对高脂-脂肪肝模型大鼠肝脏COX-2、INOS表达的影响［J］.中华临床医师杂志，2013，7（5）：2 001-2 005.

［14］韩丽，田莉.维药芹菜根研究概况［J］.中国中医药信息杂志，2016，23（4）：124-126.

［15］周明明，田莉，陈妍，等.维药芹菜根醇提物对D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝损伤的保护作用［J］.北京中医药大学学报，2010，33（12）：834-836.

Curative Effect and Mechanism of Total Flavonoids in Roots of Petroselinum Crispum on Nonalcoholic Fatty Liver Rat Model

Xie Jingwen1，Chen Yan1，Jia Manjing1，Zhu Manli2，Lei Linjie1
（1.The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Wulumuqi，Xinjiang，China830063；2.Xinjiang Medical University，Wulumuqi，Xinjiang，China830011）

ObjectiveTo explore the effect mechanism of total flavonoids in roots of petroselinum crispum on nonalcoholic fatty liver rat model.Methods40 cases of nonalcoholic fatty liver rat model were induced by high-fat diet and then randomly divided into the normal group，model group，silymarin group and total flavonoids in roots of petroselinum crispum group，10 rats in each group.All groupwere given the corresponding treatment.Except for the normal group，the other groups were fed with high-fat diet.The plasma level of ALT，AST，TG，TC were detected and the expression of COX-2 mRNA in liver was examined by Quantitative Real-time PCR.Results The model was made successfully，and the plasma level of ALT，AST，TG，TC in model groups were higher than that in normal group.After intervention，the NAFLD rats with silymarin and total flavonoids in roots of petroselinum crispum decresed the above-mentioned four indexes obviously，and the expression of COX-2 mRNA was inhibited（P＜0.05）.The effects of total flavonoids in roots of petroselinum crispum were stronger than silymarin，but the differences were not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionThe total flavonoids in roots of petroselinum crispum has a specific curative effect on NAFLD rats.Its mechanism is related to the inhibition of COX-2 mRNA expression.

total flavonoids in roots of petroselinum crispum；nonalcoholic fatty liver disease；COX-2

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）20-0029-04

*新疆医科大学科研创新基金，项目编号：XJC201359。

（2016-06-13；

2016-08-11）