微流控芯片非接触电导检测法快速测定盐酸克林霉素的含量

童艳丽，翟海云，刘　翠，梅华清,潘育方，陈缵光

(1.广东省第二人民医院，广东　广州　510317；2.广东药科大学　药科学院，广东　广州　510006;3.中山大学　药学院，广东　广州　510006)



微流控芯片非接触电导检测法快速测定盐酸克林霉素的含量

童艳丽1，翟海云2*，刘翠3，梅华清1,潘育方2，陈缵光3

(1.广东省第二人民医院，广东广州510317；2.广东药科大学药科学院，广东广州510006;3.中山大学药学院，广东广州510006)

建立了微流控芯片非接触电导检测法快速测定盐酸克林霉素胶囊中盐酸克林霉素的方法。考察了缓冲液种类和浓度、添加剂种类、分离电压以及进样时间等因素对分离检测的影响。以2.0 mmol·L-1HAc +2.0 mmol·L-1NaAc为缓冲溶液，分离电压为1.5 kV，进样时间15.0 s，在1.0 min内实现了对盐酸克林霉素的快速分离测定。盐酸克林霉素的线性范围为20.0～200.0 μg·mL-1，相关系数(r)为0.999 2，检出限(S/N=3)为5.0 μg·mL-1，相对标准偏差为2.1%，加标回收率为95.9%～103%。该方法简便、快速，可为盐酸克林霉素检测提供新的方法和技术。

微流控芯片；非接触电导检测；盐酸克林霉素胶囊；盐酸克林霉素

盐酸克林霉素(Clindamycin hydrochloride)为林可霉素衍生物，其抗菌谱和林可霉素相同，但抗菌作用强，临床主要用于骨髓炎、厌气菌引起的感染、呼吸系统感染、胆道感染、心内膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染及败血症等。盐酸克林霉素的含量测定对药品质量控制、药物代谢动力学研究等具有重要意义。已报道的盐酸克林霉素含量测定方法有高效液相色谱(HPLC)法[1-3]、紫外-可见分光光度法[4-5]和旋光法[6]等，其中紫外-可见分光光度法及旋光法虽然简便，但选择性较差；HPLC法分析成本相对较高，试剂消耗量大，样品处理繁琐。微流控芯片分析法具有分析速度快、样品处理简单、重复性好、成本低等特点，近年受到重视[7-13]，但用于盐酸克林霉素含量测定尚未见报道。本文建立了测定盐酸克林霉素胶囊中盐酸克林霉素含量的微流控芯片-非接触电导检测法，为该药物的含量测定提供了一种方便、准确、低成本的新方法。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

微流控芯片分析仪(型号CCD-08B，中山大学药学院医药仪器与应用研究所研制)：由PMMA芯片(微通道上宽30 μm，下宽100 μm，深30 μm，进样通道为十字结构，分离通道长44 mm，有效分离长度43 mm)、微型压电陶瓷高压电源[14]、非接触电导检测器[15]和数据工作站组成；循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，巩仪市英峪予华仪器厂)；超声波提取器(DA-3A型，顺德乐从灵通电子厂)；数据记录与处理在普通微机上完成。

三羟基氨基甲烷(Tris)，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，上海生工生物工程有限公司)，盐酸克林霉素对照品(中国药品生物制品检定所)；盐酸克林霉素胶囊(广东台城制药股份有限公司，批号20140802)；其它试剂均为国产分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2对照品与样品溶液的制备

精密称取盐酸克林霉素对照品0.050 0 g，用水溶解并定容至50 mL容量瓶中，制得1.00 mg·mL-1的储备液，于4 ℃冰箱内保存。各种浓度的对照品溶液可在临用时由储备液稀释得到。

取盐酸克林霉素胶囊20粒，称总重，将内容物全部倒出，混匀，囊壳用水冲洗干净后吹干并称重，求得胶囊内容物的平均质量。精密称取1粒胶囊量(约相当于0.15 g盐酸克林霉素)，转入100 mL容量瓶，加水，超声振荡10 min使之溶解，冷却后加水定容，摇匀。精密量取滤液1.0 mL，置于10 mL容量瓶内，用水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。

进样前所有溶液均过0.22 μm微孔滤膜。

1.3分离测定

新芯片使用前用0.1 mol·L-1HNO3冲洗并浸泡20 min左右。每次实验使用芯片前，十字通道依次用0.1 mol·L-1NaOH活化15 min，水冲洗10 min，缓冲液平衡15 min。

一次实验结束后，若仍使用同种缓冲液，则只需用该缓冲液冲洗通道2～3 min后平衡10 min左右；若更换缓冲液，则需重新活化以确保有较好的分离检测重现性。每天实验结束后，依次用水、0.1 mol·L-1HNO3冲洗通道，再用水充满通道，以防堵塞。进样电压100～500 V，分离电压500～4 000 V；非接触电导检测器的激发电压选择60 V(Vp-p)，激发频率60 kHz[9]。实验在恒温(25 ℃)、恒湿(55%)条件下进行。

2　结果与讨论

2.1缓冲溶液的选择

缓冲液对样品的分离度和检测灵敏度具有很大影响，是分离检测条件优化的重要因素。实验考察了H3BO3-NaH2PO4、柠檬酸-甘氨酸、MES-Tris、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸、柠檬酸、乳酸等缓冲液体系在不同浓度、不同配比条件下对分离和检测效果的影响。结果发现，在柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-甘氨酸、乳酸、柠檬酸等缓冲体系中，基线漂移、噪音大，杂峰较多，盐酸克林霉素的峰形和分离效果较差。在醋酸缓冲体系中，基线平稳，盐酸克林霉素出峰快，但与水峰接近，分离度欠佳。在MES-Tris和H3BO3-NaH2PO4缓冲体系中，基线不稳定，且盐酸克林霉素不出峰。而在醋酸-醋酸钠缓冲体系中，基线较稳定，电泳电流小，且盐酸克林霉素的峰形较好，与杂质峰和水峰分离度大，灵敏度高，故选择醋酸-醋酸钠作为最佳缓冲体系。

实验还考察了醋酸-醋酸钠的不同浓度和浓度比对分离检测效果的影响，结果显示，当醋酸-醋酸钠的浓度比为2.0 mmol·L-1∶2.0 mmol·L-1时，盐酸克林霉素的峰高最大，且峰形最好。综合考虑，选择2.0 mmol·L-1HAc+2.0 mmol·L-1NaAc(pH 3.0)为分离介质。

2.2添加剂的影响

考察了甲醇、乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、β-环糊精(β-CD)等添加剂对分离和检测的影响，各以5%～10%的浓度进行添加。结果发现，添加剂对盐酸克林霉素的分离检测并无明显改善，甚至会使其峰形变差，故选择不加任何添加剂。

2.3进样时间

考察了进样时间(5.0～20.0 s)对分离检测的影响。结果表明，随着进样时间的延长，盐酸克林霉素的峰高增大，但当进样时间超过15.0 s后，其增高的幅度减少，且峰形变差。综合考虑，选择进样时间为15.0 s。

2.4分离电压

在分离通道内径和长度固定的条件下，一定范围内提高分离电压有利于样品分离，但组分的迁移时间和分离电压成反比。实验考察了分离电压在0.5～3.5 kV范围内对样品分析的影响。结果表明：当分离电压高于1.5 kV时，电压对迁移时间的影响幅度降低；当分离电压达到3.5 kV时，基线有明显的毛刺，且高压电极与微芯片缓冲液池内的接触面有放电现象。综合考虑，选择分离电压为1.5 kV。

2.5线性关系、检出限及精密度

用对照品储备液配制系列浓度的标准溶液，在上述优化条件下进样，考察峰高(Y，μV)与对应浓度(X，μg/mL)的关系，确定线性范围为20.0～200.0 μg·mL-1，线性方程为Y=1 447X+19 824，相关系数(r)为0.999 2。检出限(S/N=3)为5.0 μg·mL-1。以浓度为100.0 μg·mL-1的盐酸克林霉素对照品溶液重复进样6次，测得盐酸克林霉素峰高的相对标准偏差(RSD)为2.1%。

2.6样品的测定及回收率

在选定条件下，盐酸克林霉素对照品溶液和盐酸克林霉素胶囊样品溶液的芯片毛细管电泳图谱见图1，取样品溶液3次测定所得峰高的平均值，代入线性回归方程计算得每粒胶囊中盐酸克林霉素的含量为0.142 g/粒(标示量为0.15 g/粒)，为标示量的94.5%。以此测定值，将试液配成含盐酸克林霉素94.5 μg/mL的溶液3份，按高、中、低浓度分别加入盐酸克林霉素对照品溶液，测得回收率为95.9%～103%(表1)。

3　结　论

本文采用微流控芯片非接触电导检测法测定盐酸克林霉素胶囊中盐酸克林霉素的含量，方法简便快速，重复性好，可用于盐酸克林霉素胶囊的质量控制。

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Rapid Determination of Clindamycin Hydrochloride by Contactless Conductivity Detection with Microfluidic Chip

TONG Yan-li1,ZHAI Hai-yun2*,LIU Cui3,MEI Hua-qing1,PAN Yu-fang2,CHEN Zuan-guang3

(1.Guangdong No.2 Provincial People’s Hospital,Guangzhou510317,China;2.College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou510006,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou510006,China)

A method for the rapid determination of clindamycin hydrochloride in clindamycin hydrochloride capsules by microchip capillary electrophoresis with contactless conductivity detection was developed.Influence parameters on the separation and detection such as type and concentration of buffer,type of additive,separation voltage and injection time were investigated.Under the optimal conditions,using 2.0 mmol·L-1HAc-2.0 mmol·L-1NaAc as buffer solution,clindamycin hydrochloride was separated and detected within 1.0 min at a separation voltage of 1.5 kV and an injection time of 15.0 s.Clindamycin hydrochloride showed a good linear response in the range of 20.0-200.0 μg·mL-1,with a correlation coefficient(r) of 0.999 2.The limit of detection(S/N=3)was 5.0 μg·mL-1with RSD of 2.1%,and the recoveries were in the range of 95.9%-103%.This method was simple and rapid,and could be used for the detection and quality control of clindamycin hydrochloride in clindamycin hydrochloride capsules.

microfluidic chip；contactless conductivity detection；clindamycin hydrochloride capsules；clindamycin hydrochloride

2015-12-14；

2016-03-24

国家自然科学基金(21375152)；广东省自然科学基金(21005021)；广东省科技计划项目(2014A020221098)

翟海云，博士，副教授，研究方向：药物分析，Tel:020-39352135,E-mail：zhaihaiyun@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.021

O657.1;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0893-04

实验技术