高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中14种禁用着色剂

姜子波，任国杰，毛希琴，李春玲，张国翠，王灵芝

(1.大连市产品质量检测研究院，辽宁　大连　116630;2.大连市食品检验所，辽宁　大连　116630)



高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中14种禁用着色剂

姜子波1，任国杰1，毛希琴2*，李春玲1，张国翠1，王灵芝1

(1.大连市产品质量检测研究院，辽宁大连116630;2.大连市食品检验所，辽宁大连116630)

采用液相色谱-质谱联用法建立了同时测定化妆品中14种禁用着色剂(吖啶黄、酸性紫49、溶剂红49、溶剂蓝35、氯化四甲基副玫瑰苯胺、氯化五甲基副玫瑰苯胺、氯化六甲基副玫瑰苯胺、颜料橙5、颜料红53、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、罗丹明B、分散黄3)的分析方法。待测样品经四氢呋喃分散，并对目标物进行提取后，用含有醋酸铵的甲醇-水混合溶液将基质析出，提取液离心过滤后，以10 mmol/L醋酸铵-乙腈作为流动相在Agilent poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)色谱柱上梯度洗脱进行分离，以色谱峰的峰面积用标准曲线外标法进行定量。在优化条件下，各目标物的线性范围为0.01～1.0 μg/mL，相关系数均大于0.999。14种禁用着色剂的定量下限为0.05～0.5 μg/g。在低、中、高3个加标水平下，各目标物的回收率为85.4%～106.3%，相对标准偏差(RSD)均低于10%。方法准确、简便、灵敏、可靠，可用于化妆品中此14种禁用着色剂的定量测定。

化妆品；禁用着色剂；高效液相色谱-串联质谱法

着色剂是化妆品中起赋色及美化作用的重要原料，因此着色剂原料的质量对于化妆品的产品质量至关重要。化妆品中使用的着色剂多为人工合成，而合成所用原料多为煤焦油产物、质量不高的人工合成着色剂，为降低生产成本，纯化精炼过程还存在偷工减料的现象，甚至无纯化过程，生产出的着色剂含有大量对人体健康有严重危害的化学物质。假冒伪劣化妆品的主要特征之一是使用质量低劣的着色剂原料，甚至禁用着色剂。在化妆品中使用禁用着色剂能引起皮肤过敏、毒性反应，甚至诱发癌变[1-2]。对化妆品中着色剂的使用进行质量监管，可以有效遏制低劣着色剂的滥用现象，保障化妆品的产品质量。

《化妆品卫生规范》(2007版)[3]虽然明确给出了禁用的着色剂列表，但未给出相应的检测方法,《化妆品安全技术规范》(2015年版)中所收录的禁用着色剂的检测方法仅涉及5种禁用着色剂。已有文献中涉及的禁用着色剂有13种[4-11]，钱晓燕等[11]以液相色谱-质谱联用方法测定了化妆品中的12种合成着色剂，其中包括11种禁用着色剂。目前关于禁用着色剂的检测标准均采用高效液相色谱法，包括GB/T 29663-2013《化妆品中苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的测定 高效液相色谱法》、国食药监保化[2012]13号附件15方法以及GB/T 30927-2014《化妆品中罗丹明B等4种禁用着色剂的测定 高效液相色谱法》，单个标准方法中最多涉及5种禁用着色剂。已有研究显示，现有检测方法和手段很难满足目前化妆品领域对禁用着色剂使用安全的质量监管要求。本课题组开发了同时测定《化妆品卫生规范》(2007版)禁用物质列表第369-378条、第310条和第451条中明确单项规定的14种禁用着色剂的高效液相色谱分析方法[12]。通过对101个实际样品的分析发现，液相色谱法作为定性定量的主体方法，基本可以满足实际样品的分析要求，但当部分阳性样品中禁用着色剂的含量很低甚至低于方法检出限时，液相色谱法的定性定量可靠性较低，甚至会出现假阳性或假阴性结果。本文开发了14种禁用着色剂的液相色谱-质谱联用测定方法,通过化合物的母离子、碎片子离子以及母离子与子离子的离子丰度比来判断样品中是否含有目标物质，与液相色谱仅靠紫外光谱对化合物定性相比，可有效地避免假阳性或假阴性结果，提高了定量的准确性。

1　实验部分

1.1仪器与材料

高效液相色谱-串联质谱仪(Agilent 6490，ESI源)；分析天平(感量0.1 mg，0.01 mg)；超声波清洗器；离心机(转速不小于5 000 r/min，离心试管容量10 mL，15 mL)；XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)；0.22 μm PTFE(聚四氟乙烯)微孔滤膜。

颜料红53(日本TCI公司)，溶剂红49(美国International Laboratory公司)，氯化四甲基副玫瑰苯胺、氯化五甲基副玫瑰苯胺、氯化六甲基副玫瑰苯胺、酸性紫49、分散黄3、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、颜料橙5、溶剂蓝35、罗丹明B、吖啶黄(百灵威科技有限公司)，上述着色剂的纯度均大于98%；甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck 公司)；四氢呋喃(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；醋酸铵(色谱纯，美国Alfa Aesar 公司)。

1.2溶液配制

1.2.1醋酸铵甲醇-水溶液称取0.77 g醋酸铵加至100 mL水中充分溶解，再加入100 mL甲醇，充分混匀后，制得醋酸铵浓度为50 mmol/L的醋酸铵甲醇-水溶液。

1.2.2标准储备溶液称取分散黄3、颜料橙5各10 mg(精确至0.1 mg)，分别用甲醇和四氢呋喃溶解后，定容至50 mL，配成浓度为0.2 mg/mL的标准储备液。称取苏丹红Ⅳ和颜料红53各10 mg(精确至0.1 mg)，分别用四氢呋喃和二甲基亚砜溶解后，定容至10 mL，配成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。称取其余9种标准物质(除分散黄3、颜料橙5、罗丹明B、苏丹红Ⅳ和颜料红53外)各10 mg(精确至0.1 mg)，分别用甲醇溶解后定容至10 mL，配成各目标物浓度为1 mg/mL的标准储备溶液(鉴于罗丹明B实为溶剂红49的盐酸盐，在同一色谱条件下与溶剂红49的出峰相同，方法无法区分罗丹明B与溶剂红49，因此配制标准储备液时可根据标物情况任选一种配制)。

1.2.3标准溶液的配制准确移取分散黄3、颜料橙5的标准储备液各1 mL，其余标准储备液各200 μL于同一10 mL容量瓶中，用甲醇-四氢呋喃(1∶1)定容至刻度，配成20 mg/L的混合标准溶液，再用甲醇逐级稀释配成1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.01 mg/L的系列混合标准溶液，用于标准曲线的绘制。

1.3试样制备

称取待测化妆品样品约0.2 g(精确至1 mg)于刻度离心管中，加入6 mL四氢呋喃，涡旋或超声分散提取，继续向离心管中加入醋酸铵甲醇-水溶液定容至 10 mL，涡旋混匀，超声10 min，经5 000 r/min离心5 min。取澄清提取液，过0.22 μm PTFE微孔滤膜后待测。

1.4仪器分析条件

1.4.1液相色谱分离条件色谱柱：Agilent poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)；流动相为10 mmol/L醋酸铵溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱条件：0～4 min，50%～85% B；4～5 min，85%～100% B；5～7 min,100% B；7～7.1 min，100%～50% B；7.1～10 min，50% B。柱温：35 ℃。流速：0.5 μL/min。进样量：2 μL。

1.4.2质谱分析条件离子源：电喷雾电离源(ESI源)；离子源温度：250 ℃；检测方式：多反应监测(MRM)；雾化气：氮气，30 psi；干燥气：氮气，流速14 L/min；鞘气温度：350 ℃，流速：11 L/min；碰撞气：氮气；毛细管电压：3 500 V；碰撞电压：380 V；其他质谱参数见表1。

表1　14种目标物的质谱分析参数

*quantitative ion

2　结果与讨论

2.1样品前处理条件的优化

考虑到化妆品样品的分散性以及目标物的溶解性，并结合实验验证，发现四氢呋喃可以将样品分散并对各目标物具有良好的提取效率，而在溶液中加入极性较大的甲醇-水溶液可增加体系的极性，并使样品中基质成分(如唇膏中的蜡基及指甲油中大分子的赋形剂等基质)基本析出，从而避免了这些物质对反相色谱柱的损害，延长了色谱柱的使用寿命。而醋酸铵的加入可以有效地改善部分目标物因基质吸附造成的回收率偏低现象。经过不同的溶剂比例组合调整，确定以四氢呋喃、甲醇与水的体积比为3∶1∶1，醋酸铵浓度为20 mmol/L的溶剂体系作为提取溶液。

2.2液相色谱条件的优化

2.2.1色谱柱的选择选择合适的色谱柱是分析方法的关键。实验考察了14种目标成分在C18色谱柱上的分离效果，结果显示TMPC，PMTPE，HMPC在普通C18色谱柱上保留过强，且HMPC的色谱峰峰形严重展宽，与其他化合物的色谱峰重叠严重。鉴于这3种化合物的结构性质，推测造成化合物保留太强的原因可能是目标物与固定相上残余硅羟基之间的相互作用所致。尝试选择Aiglent poroshell 120 EC-C18色谱柱用于改善14种目标化合物的色谱分离。研究显示，在优化色谱条件下，该色谱柱上可实现14个目标物的色谱分离并获得13个基线分离的色谱峰(鉴于在同一色谱条件下罗丹明B与溶剂红49的出峰时间相同，方法无法分辨是罗丹明B或溶剂红49，此两个化合物被作为一种化合物进行色谱分析，因此14种目标物实际最多只能显示13个色谱峰)。实验最终选择Aiglent poroshell 120 EC-C18作为色谱柱进行分离。

2.2.2流动相中洗脱溶剂及改性剂的优化由于该14个目标物的结构性质差异较大，所以在形成离子过程中所带正负电荷的能力不同，一部分容易形成正离子，一部分容易形成负离子。因此根据其所易形成离子的带电性质，经过实验筛查，将目标物分成两组(负模式：吖啶黄、颜料红53、分散黄3、颜料橙5；正模式：酸性紫49、溶剂红49、TMPC、PMTPE、HMPC、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、溶剂蓝35、罗丹明B)并调整液相色谱条件得到合适的溶剂环境，以获得最大的离子响应强度。结果显示，负模式下以10 mmol/L醋酸铵溶液为水相，乙腈-甲醇(6∶4)为有机相时各负模式目标物可获得良好的质谱响应；正模式下以0.3‰甲酸溶液为水相，乙腈为有机相时各正模式目标物可获得良好的质谱响应。另外在实验过程中发现，过大浓度酸的加入会导致部分目标物形成多电荷离子，从而降低其响应。鉴于这两个溶剂系统的差异较大，不能对该14种目标物进行同时测定，为此对所用溶剂系统进一步优化。实验比较发现，以10 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈为溶剂系统时，正负模式条件下的各离子均有良好响应，为此选择10 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈为溶剂系统。

2.3质谱条件的优化

将14 种着色剂标准溶液在质谱上进行全扫描，在ESI+模式下得到酸性紫49 等10种化合物的分子离子峰;在ESI-模式下得到吖啶黄等4个化合物的分子离子峰。通过优化锥孔电压、碰撞能等参数，得到14种化合物的子离子，每种物质选择2个子离子，以响应值高的子离子作为定量离子，另一个作为定性离子。14种着色剂的定量和定性离子及相应的质谱参数见表1。

在该优化仪器条件下，各标准物质浓度为0.1 μg/mL时14种标准物质的多反应检测谱图如图1所示。由于同一色谱条件下，罗丹明B与溶剂红49的出峰相同，此两个化合物实被作为一种化合物进行色谱分析，因此14种目标物实际最多只能显示13个相应色谱峰。

2.4线性范围与相关系数

移取浓度分别为1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.01 μg/mL的系列混合标准溶液，按照优化色谱条件进行分析，以系列标准溶液的质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归分析。各目标物的线性回归方程及相关系数如表2所示。结果表明,各目标物在0.01～1.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999。

表2　14种禁用着色剂的线性方程、相关系数、检出限与定量下限

2.5定量下限与回收率

向不含目标物质的空白样品中定量添加混合标准溶液，按本方法处理后进行检测，计算信噪比(S/N)。以S/N=3计算检出限(LOD)，以S/N=10计算定量下限(LOQ)，得14种目标物的LOD为0.02～0.2 μg/g，LOQ为0.05～0.5 μg/g(见表2)，方法的灵敏度可以满足日常的检测需求。

对14种目标物分别在10，2.5，0.5 μg/g 3个浓度水平下进行加标回收实验，每个水平平行测定6个样品，其回收率与相对标准偏差(RSD)见表3。由表3可知，各目标物的加标回收率为85.4%～106.3%，RSD均低于10%，方法显示了良好的回收率与精密度。

表3　14种禁用着色剂的加标回收率与相对标准偏差

(续表3)

2.6实际样品的测试

通过各大商场专卖店购买、批发市场采购和网购等渠道共获得样品101个，包括唇膏33个，粉20个，指甲油45个，粉底液1个，修容霜1个，眉笔1个。样品品牌涉及进口品牌、国产品牌以及市场零售“三无”彩妆产品。取待测样品，按“1.3”进行试样制备，“1.4”进行测定。

对测试结果进行分析发现，有12个样品检出颜料红53，6个样品检出溶剂红49(或罗丹明B)，1个样品检出颜料橙5，定量结果见表4。

表4　实际样品中禁用着色剂的检出情况

*F:powders,C:lipstick,Z:nail polish

表4结果显示，检出的阳性样品仅涉及颜料橙5、颜料红53和溶剂红49(罗丹明B)，其他着色剂未检出。测试结果同时显示，同一着色剂在不同化妆品中的含量差异较大，如实际样品中染料红53的最小含量为7.06 μg/g(提取溶液浓度约为0.14 μg/g)，最大含量为2 666.5 μg/g(提取溶液浓度约为53 μg/g)，含量相差几百倍。对目标物浓度较大的样品，如果直接进入质谱仪测定易造成管路堵塞或者仪器污染。因此，对于着色剂这种常量物质的分析，一般只需使用液相色谱法即可满足测试要求，在液相色谱分析遇到干扰或目标物含量较小时，采用液相色谱-质谱联用方法可增加方法的准确性。另外液相色谱-质谱联用方法还可用于对液相色谱测试结果为阳性的样品进行确证，以确保结果的准确性。此外，在用质谱进行测试前，根据液相色谱的测试结果对样品溶液进行适当稀释后，再进行测试，有利于质谱仪的维护保养。

2.7方法应用讨论

由于液相色谱仪的普及程度远高于液相色谱-质谱联用仪，极大增加了方法的实用性，而且实际样品的测试结果显示化妆品中的着色剂用量较大，绝大部分的样品在液相色谱条件下即可实现目标物的准确定量分析，为此在实际应用中，建议选择液相色谱法作为筛查方法，而将质谱法仅作为确证方法使用。对101个实际样品验证发现，液相色谱法作为定性定量的主体方法，基本可满足实际样品的分析要求，然而当阳性样品是由于着色剂染料污染所造成时，其含量往往很低甚至低于检出限，其紫外吸收图谱的可靠性较低，这时液相方法所得结果会出现假阳性或假阴性，而采用LC-MS/MS法可以保证结果的准确性。实际检验中发现，样品中的基质会干扰目标物的质谱分析，因此需对目标物进行适当的分离。在实际应用过程中可根据液相方法中所测结果对质谱确证方法进行调整。

2.8监管建议

通过实际样品分析发现，除个别含量较高的阳性样品外，有些阳性样品的禁用物质含量较少，一般很难达到理想的染色效果，推测这部分样品中的禁用着色剂成分可能属于原料纯度不够或被污染而带入，但不排除恶意添加的可能。结合样品的购买渠道分析后发现，阳性样品均为批发市场购买及网购产品，且禁用着色剂的检出频率较高(约为16%)，而各大商场采购的正规品牌样品中未检出阳性样品，这可能是由于“网购产品”及“地摊货”多为假冒伪劣产品和“三无产品”，在其生产过程中使用了劣质着色剂，或因其注重于色彩的绚丽而忽略了同样染色效果的不同着色剂的安全性差异，从而造成着色剂的误用。上述研究结果显示，对于禁用着色剂原料监管及其产品的分析检测十分必要，其中加强原料质量的控制及“网购产品”和“地摊货”的质量监管是控制彩妆安全的关键。

3　结　论

本文采用液相色谱-质谱联用技术建立了化妆品中14种禁用着色剂测定的分析方法。空白样品加标实验及实际样品测定结果表明，该方法准确、简便、灵敏、可靠，可用于化妆品中此14种禁用着色剂的同时定量测定，对其液相色谱的测定方法进行了有效补充，能够为政府法规的执行和化妆品的质量监管提供有效的技术支持和保障。

[1]Zheng X Q,Zhou S Y,Zhou S W.CosmeticsHealthInspectionManual.Beijing:Chemical Industry Press(郑星权,周淑玉,周世伟.化妆品卫生检验手册.北京:化学工业出版社),2003:17-31,371.

[2]Stiborova M,Martinek V,Rydlova H,Hodek P,Frei E.CancerRes.,2002,62:5678-5684.

[3]Ministry of Health of the People’s Republic of China.HygienicStandardforCosmetics.Beijing:China Standard Press(中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范.北京:中国标准出版社),2007:17.

[4]Lin W X,Sun X Q,Zhao X R,Xu W,Guo G Y.Chin.J.Chromatogr.(林维萱,孙兴权,赵雪蓉,徐伟,郭桂媛.色谱),2012,30(5):527-532.

[5]Wang Y,Ma Q,Bai H,Wang C,Ding L,Meng X S,Chen Y X.J.Instrum.Anal.(王烨,马强,白桦,王超,丁岚,孟宪双,陈云霞.分析测试学报),2012,31(10):1288-1293.

[6]Ge B K,Chen Q Y,Zhao K X,Chang C Y,Gao J H.J.Environ.Health(葛宝坤,陈其勇,赵孔祥,常春燕,高健会.环境与健康杂志),2007,24(11):917-918.

[7]Wegener J W,Klamer J C,Govers H,Brinkman U A T.Chromatographia,1987,24:865-875.

[8]Zhao X R,Yu Y M,Xu W,Lin W X,Li X L,Guo G Y.SpecialtyPetrochemicals(赵雪蓉,于一茫,徐伟,林维萱,李晓岚,郭桂媛.精细石油化工),2012,29(6):30-33.

[9]Lu J,Li M H.FlavourFragranceCosmetics(卢剑,郦明浩.香料香精化妆品),2008,1:20-22.

[10]Tian F R,Yang W,Yang L H,Sun W S.Chem.Anal.Meterage(田富饶,杨委,杨兰花,孙文闪.化学计量分析),2012，21(6):36-39.

[11]Qian X Y,Liu H S,Zhu X Y,Chen X M,Mo W M.J.Instrum.Anal.(钱晓燕,刘海山,朱晓雨,陈笑梅,莫卫民.分析测试学报),2014,33(5):527-532.

[12]Mao X Q,Ren G J,Li C L.J.Instrum.Anal.(毛希琴,任国杰,李春玲.分析测试学报),2014,33(9):1083-1088.

Simultaneous Determination of 14 Forbidden Colorants in Cosmetics by HPLC-MS/MS

JIANG Zi-bo1,REN Guo-jie1,MAO Xi-qin2*,LI Chun-ling1,ZHANG Guo-cui1,WANG Ling-zhi1

( 1.Dalian Institute of Product Quality Supervision & Inspection,Dalian116630,China;2.Dalian Institute of Food Inspection,Dalian116630,China)

An HPLC-MS/MS methord was developed for the simultaneous determination of 14 forbidden colorants,including metanil yellow,acid violet 49,solvent red 49,solvent blue 35,tetramethylpararosaniline chloride(TMPC),pentamethyltriphenylmethane(PMTPE),hexamethylenepara-rosaniline chloride(HMPC),pigment orange 5,pigment red 53,sudan I,sudanⅡ,Sudan Ⅳ,rhodamine B,disperse yellow 3,in cosmetics.Cosmetic samples were extracted and dispersed with tetrahydrofuran,and some matrixes were precipitated out after addition of ammonium acetate solution and methanol.After centrifuged and filtered，the extract was separated on an Agilent poroshell 120 EC-C18column(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)by gradient elution with 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile as mobile phase.The quantitative analysis was performed by the standard curve method of peak area.The linear ranges of 14 analytes were in the range of 0.01-1.0 μg/mL,with correlation coefficients more than 0.999.The limits of quantitation(LOQs)were in the range of 0.05-0.5 μg/g.The average recoveries at three spiked levels ranged from 85.4% to 106.3% with RSDs less than 10%.This method is accurate,simple,sensitive and reliable,and could be used for the analysis of 14 forbidden colorants in cosmetics.

cosmetics;forbidden colorants;HPLC-MS/MS

2016-03-03；

2016-03-25

国家质检总局公益性行业科研专项项目(2012104013-8)

毛希琴，博士，教授级高工，研究方向：食品、药品、包装材料以及化妆品中功效成分及禁限用成分检测方法的研究与开发，Tel：0411-87963936，E-mail：maoxiqin@sina.com.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.003

O657.63；TQ047.2

A

1004-4957(2016)07-0792-07