还原型谷胱甘肽对缺血再灌注急性肾损伤模型大鼠的肾保护机制

侯 静 蔺 艳 欧三桃 曹 灵

(泸州医学院附属医院肾病内科,四川 泸州 646000)



还原型谷胱甘肽对缺血再灌注急性肾损伤模型大鼠的肾保护机制

侯 静 蔺 艳1欧三桃 曹 灵

(泸州医学院附属医院肾病内科,四川 泸州 646000)

目的 探讨还原型谷胱甘肽对缺血再灌注急性肾损伤(AKI)模型大鼠的肾保护机制。方法 将无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠48只随机分为假手术组(SN)、造模组(IN)和还原型谷胱甘肽治疗组(IG)，各16只，IG组在夹闭肾蒂前10 min颈静脉注射200 mg/ml的还原型谷胱甘肽，IN组给予同剂量的生理盐水，SN组仅进行假手术。术后6 h和12 h分别检测三组血肌酐(SCR)和血尿素氮(BUN)、血清白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平变化，术后6 h和12 h分批处死大鼠后取肾脏组织，检测三组丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果 术后6 h IN组与IG组SCR和BUN水平均显著高于SN组(均P<0.05)，术后12 h IG组SCR和BUN水平均显著低于IN组(均P<0.05)。术后6 h IN组与IG组IL-6水平均显著高于SN组，术后12 h IG组IL-6水平显著低于IN组(均P<0.05)；术后6 h和12 h IN组TNF-α水平均显著高于SN组(P>0.05)，IG组TNF-α水平与SN组相比无统计学差异(P>0.05)。术后6 h和12 h SN组与IG组SOD活力均显著高于IN组(P<0.05)，而SN组与IG组间比较无统计学差异(P>0.05)；术后6 h和12 h IN组MDA活力均显著高于SN组与IG组，而SN组与IG组间比较无统计学差异(P>0.05)。结论 还原型谷胱甘肽治疗缺血再灌注AKI大鼠疗效确切，能有效清除氧自由基和改善炎症状态，值得进一步研究。

缺血；再灌注；急性肾损伤；还原型谷胱甘肽

急性肾损伤(AKI)是临床常见的危重症，发病机制迄今为止尚未阐明，发病诱因多种多样，常见的有缺血、再灌注损伤、免疫反应、毒素、炎症等，若得不到及早诊断和治疗，AKI常会导致不可逆的肾损伤，病死率高达50%〔1〕。缺血再灌注损伤是导致AKI的重要因素，病理机制是产生大量氧自由基，导致多种不饱和脂肪酸过氧化，损伤膜脂质，引起膜功能受损，破坏肾脏细胞，同时这一过程中释放的大量炎症因子也加重了损伤〔2〕。还原型谷胱甘肽是人体内自身合成的一种活性成分，具有酶活性和抗氧化活性，是体内重要的自由基清除剂〔3〕。本研究采用还原型谷胱甘肽对缺血再灌注AKI大鼠进行术前干预，分析其干预效果和机制。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠48只，体重200～240 g，购自上海史莱克实验动物有限公司(合格证号：201000050435)，饲喂在我院动物实验中心，予全颗粒鼠饲料，自由摄食、取水，调节12 h/12 h昼夜节律，温度及湿度适宜，适应性饲喂1 w后开始试验。

1.2 试剂和仪器 还原性谷胱甘肽(商品名：阿拓莫兰，重庆药友制药有限责任公司，国药准字H20051599，规格：1.0 g/支)，生理盐水、戊巴比妥均购自北京化学试剂公司，白细胞介素(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒均购自美国R&D公司，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 动物分组和造模方法 将48只大鼠随机分为假手术组(SN组)、造模组(IN组)、还原型谷胱甘肽治疗组(IG组)各16只。实验动物造模手术前禁食12 h，手术前用4%戊巴比妥50 mg/kg体重腹腔注射麻醉，确认麻醉后颈、腹部备皮，取仰卧位，铺消毒巾，延腹部正中线切开大鼠皮肤和肌肉，切口上缘距剑突0.5 cm，切口长度不超过3 cm，小心分离颈静脉，翻出肠管用生理盐水纱布保湿，用玻璃分针找到双侧肾蒂，无创血管夹夹闭双侧肾蒂，观察肾脏颜色由粉红转为苍白表明缺血处理成功，关闭腹腔，生理盐水纱布覆盖，90 min后松开血管夹，观察肾脏颜色恢复粉红表明再灌注成功，放回肠管，逐层缝合腹壁。IN组及IG组所有小鼠均造模成功。IG组在夹闭肾蒂前10 min经颈静脉注射200 mg/ml还原型谷胱甘肽，3 ml/kg体重；IN组在夹闭前给予同等剂量的生理盐水；SN组打开腹腔后行假手术，不给予任何药物或生理盐水，也不夹闭肾蒂。所有动物分两批在手术后6 h和12 h处死，每批处死8只，并收集肾脏组织标本。

1.4 指标检测 动物处死前，经下腔静脉采血2管，其中一管3 ml，采用日立7600全自动生化分析仪检测血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)；另一管4 ml室温静置30 min后，3 000 r/min离心10 min收集血清保存于-80℃冰箱中备用，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中IL-6和TNF-α水平，严格按照说明书进行操作。取部分肾脏组织，称重后在4℃冰水浴中加入适量生理盐水，采用大龙D-160手持式均质分散机制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min后取上清保存于-80℃冰箱中备用。SOD检测采用黄嘌呤氧化法，MDA检测采用硫代巴比妥酸法，操作严格按照说明书进行。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件，计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用SNK法。

2 结 果

2.1 血液生化指标变化 术后6 h、12 h三组SCR及BUN水平整体比较均有统计学差异(P<0.05)。术后6 h IN组与IG组SCr和BUN水平均显著高于SN组，且随时间增加两组SCr和BUN水平进一步升高；术后12 h IG组SCr和BUN水平均显著低于IN组(均P<0.05)。见表1。

表1 术后6 h、12 h三组大鼠SCR和BUN比较

与SN组比较：1)P<0.05，与IN组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 血清炎症因子变化 术后6 h、12 h三组血清IL-6与TNF-α水平整体比较均有统计学差异(P<0.05)。术后6 h，IN组与IG组IL-6水平均显著高于SN组，术后12 h两组IL-6水平略有下降但仍显著高于SN组，IG组IL-6水平显著低于IN组(均P<0.05)；术后6 h和12 h IN组TNF-α水平均显著高于SN组(P>0.05)，IG组TNF-α水平与SN组相比无统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.3 肾组织中SOD和MDA活力变化 术后6 h、12 h三组肾组织中SOD和MDA活力整体比较均有统计学差异(P<0.05)。术后6 h和12 h SN组与IG组SOD活力均显著高于IN组(P<0.05)，而SN组与IG组间比较无统计学差异(P>0.05)；术后6 h和12 h IN组MDA活力均显著高于SN组与IG组，而SN组与IG组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表2 术后6 h、12 h三组大鼠血清IL-6与TNF-α比较

表3 术后6 h、12 h三组大鼠肾组织中SOD和MDA活力比较

3 讨 论

AKI是多种病因所导致的危急重症，一旦发展成为急性肾衰竭，死亡率高达60%，幸存的患者中，约有10%～20%发展成为慢性肾衰竭，最终导致终末性肾脏疾病〔4〕。缺血再灌注是指组织缺血后重新获得血液灌注和氧气供给后，对组织和器官产生的损伤作用。肾脏是缺血再灌注损伤高发器官之一，通常由肾血管硬化、肾静脉栓塞、心脏骤停、严重创伤等一过性缺血性疾病所致〔5〕。既往研究发现，模型大鼠BUN和SCR水平在手术后即开始上升，到48 h达到顶峰〔6〕，而对肾脏组织的病理观察显示缺血再灌注早期，肾组织以肾小管上皮细胞非坏死性病变为主，随着再灌注时间延长出现坏死性病变；到再灌注晚期时，肾小管上皮细胞坏死、脱落明显，且皮质与髓质交界处受损最严重〔7〕。证明通过该方法建立缺血再灌注AKI大鼠模型的方法是成功的。

肾脏缺血再灌注时，主要通过氧自由基和各类细胞因子和化学分子调控〔8〕。从细胞角度分析，发现细胞内活性氧簇增加，而内源性的抗氧化物并未相应增加甚至减少，导致活性氧簇在细胞内积累，损伤细胞〔9〕；其次，组织再灌注时诱导炎症反应，分泌大量炎症因子，加重了再灌注部位组织细胞的损伤，甚至导致细胞凋亡〔10〕。本研究发现，还原型谷胱甘肽能够有效控制缺血再灌注所导致的局部炎症反应，降低炎症因子水平，减轻损伤程度。导致缺血再灌注的另一重要机制为氧自由基的产生及其所致的脂质过氧化。生理状态下体内也会产生少量活性氧簇，但是很快会被体内的SOD、过氧化氢酶等清除〔11〕，在缺血、缺氧等病理生理状态下，线粒体少量产生的氧自由基会爆发性增加，同时炎症反应募集的中性粒细胞也具有产生活性氧簇的能力〔12〕。本研究证明还原型谷胱甘肽能显著减少再灌注所致的肾组织内活性氧簇的积累，缓解组织氧化应激，减轻损伤。与此同时，接受还原型谷胱甘肽治疗的大鼠血液中BUN和SCR水平均有不同程度的降低，表明还原型谷胱甘肽在清除氧自由基和缓解炎症状态的基础上，确实能有效缓解缺血再灌注所导致的肾损伤。

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6 李金维.谷胱甘肽治疗药物性急性肾损伤的临床效果观察〔J〕.深圳中西医结合杂志，2014；24(7)：76-7.

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8 Zhuo W，Liao L，Fu Y，etal.Efficiency of endovenous versus arterial administration of mesenchymal stem cells for ischemia-reperfusion-induced renal dysfunction in rats〔J〕.Transplant Proc，2013；45(2)：503-10.

9 Yang CC，Hsu SP，Chen KH，etal.Effect of adenoviral catalase gene transfer on renal ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Chin J Physiol，2015；58(6)：420-30.

10 李宝山，刘 渠，李 强，等.氢生理盐水对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中华肝胆外科杂志，2014；20(4)：299-301.

11 Yan R，Li Y，Zhang L，etal.Augmenter of liver regeneration attenuates inflammation of renal ischemia/reperfusion injury through the NF-kappa B pathway in rats〔J〕.Int Urol Nephrol，2015；47(5)：861-8.

12 Scindia Y，Dey P，Thirunagari A，etal.Hepcidin mitigates renal ischemia-reperfusion injury by modulating systemic iron homeostasis〔J〕.J Am Soc Nephrol，2015；26(11)：2800-14.

〔2015-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

2010年泸州医学院科研课题(No.院发2011-43号)

侯 静(1973-)，女，硕士，副教授，主要从事临床肾脏病研究。

R692.3

A

1005-9202(2016)22-5537-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.019

1 西南医科大学肿瘤研究所