PNU上调大鼠皮质星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集

任真奎 杨 梅 官志忠 禹文峰

(贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)



PNU上调大鼠皮质星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集

任真奎 杨 梅 官志忠 禹文峰

(贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

目的 探讨PNU激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nAChRs)上调内源性B-晶状体蛋白(Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(Aβ)集聚的现象及其机制。方法 分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定；体外制备Aβ1～42寡聚体；将细胞分为对照组、PNU组、PNU+α7 nAChRs阻断剂(MLA)组、Aβ1～42组、PNU+ Aβ1～42组、PI3K信号通路阻断剂LY294002+PNU+ Aβ1～42组。用蛋白印迹法检测细胞内Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚体的表达水平。结果 (1)PNU可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白(P<0.05)；应用MLA阻断α7 nAChRs后，PNU上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制(P<0.05)；使用LY294002阻断PI3K信号通路后，PNU上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制(P<0.01)；(2)PNU能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平(P<0.05)；应用MLA阻断α7 nAChRs后，PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制(P<0.01)；使用LY294002阻断PI3K信号通路后，PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制(P<0.01)；(3)在细胞裂解液及培养基中，PNU显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用(P<0.01)；使用LY294002阻断PI3K信号通路后，PNU增强星形胶质细胞抑制Aβ聚集的功能显著减弱(P<0.01)。结论 PNU通过激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚；PI3K/Akt信号通路可能参与PNU激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。

星形胶质细胞；阿尔茨海默病；α7胆碱能受体；PNU；B-晶状体蛋白；β淀粉样蛋白

β淀粉样蛋白(Aβ)聚集是阿尔茨海默病(AD)核心发病机制，Aβ的聚集不仅可以导致神经细胞凋亡，也可以破坏突触结构和功能，从而导致记忆和认知功能障碍〔1〕。Aβ的聚集能够激活星形胶质细胞释放细胞因子、炎性因子从而导致脑内的神经炎症〔2〕。

α7胆碱能受体(α7 nAChRs)广泛分布于大脑皮质和海马的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞〔3〕。在 AD 的发病机制中，α7 nAChRs通过与Aβ相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年来的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神经毒性的一个重要靶点〔5〕。B-晶状体蛋白(Cryab)在大脑内具有许多重要的生理功能：抗炎、抗凋亡和神经保护等〔6〕。在AD大脑中，星形胶质细胞表达的Cryab蛋白明显上调，并且这些上调的Cryab蛋白紧密地分布在Aβ蛋白沉积周围〔7〕。Cryab蛋白能够通过与Aβ蛋白直接结合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其细胞毒性作用〔8〕。

PNU是α7 nAchR激动剂中特异性较高的合成物，与其他nAchR亚单位结合微乎其微，与α7 nAChR结合，提高和改善AD动物模型的认知和记忆功能〔9〕。PNU通过激活星形胶质细胞α7 nAChR提高细胞的存活与抗凋亡〔10〕，但在星形胶质细胞模型中，PNU是否能增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制及其机制尚不清楚。

我们前期研究结果证实，用PNU激活星形胶质细胞a7 nAChRs能够显著增强星形胶质细胞对 Aβ聚集的抑制，但具体调控机制不清楚。基于Cryab蛋白的特性，推测星形胶质细胞内源性Cryab蛋白可能是PNU介导Aβ聚集的中间环节。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 胎牛血清及DMEM培养基购于Gibco公司(美国)；Aβ1～42肽、六氟异丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、PNU、methyllycaconitine (MLA) 购于Sigma公司(美国)；青-链霉素及胰蛋白酶购于Hyclone公司(美国)；6E10抗体购自BioLegend公司(美国)；鼠抗Cryab(αB-crystallin)单克隆抗体购自Abcam公司(美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔、抗鼠二抗；鼠抗β-肌动蛋白(β-actin) 单克隆抗体；磷脂酰肌醇子-激酶- 蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的抑制剂LY294002及相关位点的抗体购于CST公司(美国)；抗体稀释液、封闭液、聚丙烯酰胺凝胶购自碧云天公司；高效显影胶片、显影液、定影液购自柯达公司；电化学增强发生法(ECL-Plus)试剂及聚乙烯二氟(PVDF)膜购于Millipore公司(美国)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司(美国)；倒置显微镜(Olympus)；-80℃冰箱(美国Thermo公司)；高速离心机(德国Eppendorf公司)；ELX 800酶标仪 (美国 Bio-tec公司)；CO2培养箱(日本SANYO公司)。

1.2 Aβ1～42寡聚体的制备 参照Klein〔11〕体外制备Aβ1～42寡聚体的方法，将预冷的六氟异丙醇(HFIP)加入Aβ1～42粉末中，使其充分溶解后常温孵育60 min。随后为使HFIP挥发完全，将其放在常温下通风橱过夜。将干燥的肽膜于-80℃保存，使用时取出用DMSO溶解，再用含十二烷基硫酸钠(SDS)的硝酸盐缓冲液(PBS)稀释后，4℃存放2 w，冰冻高速离心(10 min、14 000 g/min)，上清液即为寡聚体。

1.3 星形胶质细胞培养传代及鉴定 参照McCarthy等〔12,13〕的方法并改进，取24～48 h内新生SD乳鼠的大脑皮质(贵州医科大学动物实验中心提供)，动物合格证号：SCXK(黔)2012-0001，将其大脑皮质剪成泥状，消化漂洗后，加入含1%双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)、10%FBS的高糖DMEM培养基，吹打成细胞悬液，接种至培养瓶，5%二氧化碳、37℃恒温培养。24 h后换液，之后每3天换1次液直至细胞铺满瓶底。培养8～9 d，纯化并传3～4代。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)细胞免疫荧光法对星形胶质细胞进行染色，鉴定细胞纯度。

1.4 分组及细胞处理 将培养好的星形胶质细胞纯化、传代并鉴定后，以5×105的密度种入六孔板内。将细胞分为对照组、PNU组、PNU+MLA组、Aβ1～42组、PNU+ Aβ1～42组、PNU+ LY294002+ Aβ1～42组。PNU+MLA组预先加入MLA处理2 h，随后加入PNU；PNU+ LY294002+ Aβ1～42组，预先加入LY294002处理2 h，随后加入PNU孵育18 h，换液后，用DMEM培养基吹洗3次，加入终浓度为1 μmol/L的Aβ1～42寡聚体继续在37℃ 、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.5 蛋白印迹法 从六孔板中收集细胞，加入细胞裂解液(100 μl/孔)，4℃、12 000 r/min离心20 min后取上清，将提取的蛋白质用BCA蛋白定量试剂盒定量后分装保存(-80℃)，用Western印迹方法检测Cryab、P-Akt(ser473)及Aβ蛋白表达水平。12%的梯度胶电泳，蛋白样品分离后转移至PVDF膜，5%胎牛血清(BSA)室温封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBS-T)漂洗(3次×10 min)，加入相应一抗，4℃孵育过夜，TBS-T漂洗(3次×10 min)后加入HRP标记二抗室温孵育1 h，TBS-T漂洗(3次×10 min)后曝光。用ImageJ软件分析曝光结果，以β-actin为内对照。

1.6 统计学方法 应用SPSS22.0软件，两组间比较采用t检验，多组间采用one-way ANOVA分析。

2 结 果

2.1 PNU显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用 在原代星形胶质细胞培养模型上，用α7 nAChRs 激动剂PNU处理细胞，能够显著增加星形胶质细胞对细胞内(Aβ1～42组86.22±8.56，PNU+Aβ1～42组53.13±11.56)和细胞培养液内(Aβ1～42组100.74±3.98，PNU+Aβ1～42组54.63±13.58)Aβ聚集的抑制作用,见图1。

图1 PNU增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用

2.2 PNU显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白表达水平 课题组前期结果显示，PNU以5 μmol/L刺激星形胶质细胞后对Cryab蛋白的上调作用最为明显。以5 μmol/L PNU处理星形胶质细胞在不同的时间段(6，12，18，24 h)，对Cryab蛋白的上调效应表现出时间依赖性，0、6、12、18、24 h Cryab蛋白表达量分别为102.71±13.08，223.99±25.32，336.57±60.78，427.32±26.73，340.65±55.40，18 h达到稳定阶段，选择该时间、浓度(18 h、5 μmol/L)作为后继研究。PNU刺激后 Cryab的表达量升高。见图2。

2.3 PNU通过激活α7 nAChRs而上调Cryab蛋白水平 PNU刺激星形胶质细胞后α7nAChRs的表达上调。本研究选取α7nAChRs的特异性阻断剂 MLA，以50、100、150 nmol/L MLA预先处理星形胶质细胞2 h后，再加入5 μmol/L PNU共同孵育18 h。不加PNU、MLA时Cryab蛋白表达量为95.54±9.14；加PNU 5 μmol/L及0、50、100、150 nmol/L MLA后Cryab蛋白表达量依次为128.92±15.65，81.01±20.15，75.71±3.03，84.28±6.63。MLA刺激星形胶质细胞后PNU上调内源性 Cryab的效应受到抑制。见图3。

图2 PNU上调内源性Cryab蛋白

图3 PNU通过激活α7 nAChRs而上调内源性Cryab蛋白

2.4 PI3K/Akt信号通路参与PNU激活α7 nAChRs上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白 不加PNU，P-Akt蛋白表达量为93.67±3.84。以5 μmol/L PNU处理星形胶质细胞在不同时间段(5，10，20，30 min)，对P-Akt(ser473)蛋白的上调效应表现出时间依赖性并且20 min达到稳定阶段，0、10、20、30 min时P-Akt蛋白表达量分别为110.66±9.80，97.55±17.93，132.98±13.23，138.40±24.292 0 min被选择作为后继实验。该上调作用被PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002或α7 nAChRs的阻断剂MLA抑制。不加PNU、LY294002时，P-Akt表达量为98.08±5.61，仅加PNU 5 μmol/L时P-Akt表达量为143.99±6.64，PNU及LY294002共同作用时，P-Akt表达量为57.85±8.930。不加PNU、MLA时，P-Akt表达量为98.10±6.34，仅加PNU时，P-Akt表达量为144.03±14.53；PNU及MLA共同作用时，P-Akt表达量为75.20±12.96。见图4，图5。

不加PNU、LY294002时，Cyab表达量为91.72±7.27；仅予PNU时为Cryab表达量为134.29±20.74，LY294002预先处理星形胶质细胞2 h，再加入PNU共同孵育18 h，星形胶质细胞内源性Cryab的表达受到抑制(93.40±16.30)。见图6。

图4 PNU上调P-Akt(ser473)蛋白表达

图5 LY294002或MLA能抑制P-Akt(ser473)蛋白表达

图6 LY294002能抑制内源性Cryab蛋白表达

2.5 PNU显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用与PI3K/Akt信号通路的激活相关 与Aβ1～42组相比，PNU+ Aβ1～42组的Aβ蛋白显著下调(P<0.01)；与PNU+ Aβ1～42组相比，PNU+ Aβ1～42+ LY294002组的Aβ蛋白显著上调(P<0.01)。说明PNU激活α7 nAChRs之后，通过PI3K/Akt信号通路上调Cryab，从而抑制Aβ的集聚。见表1，图7。

表1 LY294002处理星形胶质细胞后Aβ寡聚体表达的检测

与Aβ1～42组相比:1)P<0.01；与PNU+ Aβ1～42组相比:2)P<0.01

图7 PNU通过激活PI3K/Akt信号通路而抑制β-淀粉样蛋白的集聚

3 讨 论

在中枢神经系统中星形胶质细胞数量最多而且参与重要的生理功能：防止神经元损伤、提供代谢、营养支持和调节突触活动〔14〕。星形胶质细胞在Aβ聚集和沉积过程中具有双重病理角色。一方面，激活的星形胶质细胞能够通过大量分泌细胞因子，炎性因子和一氧化氮等神经毒性物质而导致AD脑内的神经炎症发生〔15〕；另一方面，活化的星形胶质细胞也能够表达与Aβ降解有关的酶，对Aβ进行有效地吞噬和降解〔16〕。基于以上事实，促进星形胶质细胞对Aβ聚集和沉积的抑制功能可能成为治疗 AD 的一个重要方向。

α7胆碱能受体是配体门控离子通道家族中的成员。它由五个跨膜亚基组成，有一个大的胞外氨基端，4个跨膜结构域和一个胞质域〔17，18〕。α7 nAChRs广泛分布于大脑皮质和海马的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞〔3〕。在 AD 的发病机制中，α7 nAChRs 通过与Aβ的相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年来的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神经毒性的一个重要靶点。在神经元细胞中，α7nAChRs能够通过激活多条细胞内信号通路而拮抗 Aβ导致的神经细胞凋亡〔19〕。在前期结果中，用PNU处理星形胶质细胞后发现α7 nAChRs的表达上调，并且能显著抑制Aβ聚集。本研究发现PNU通过激活α7nAChRs而上调Cryab蛋白水平，由此可推测PNU是通过激活星形胶质细胞的α7 nAChRs后上调内源性Cryab从而抑制Aβ的聚集。

PI3K/AKT 信号通路参与了α7 nAChRs的神经保护功能，在AD研究中发现，Akt在海马神经元中表达减少，继而导致神经元凋亡〔20〕。本实验结果说明PNU激活α7 nAChRs后，使PI3K/Akt信号通路激活引起细胞内相应的效应。进一步的研究发现LY294002能抑制PNU上调内源性Cryab蛋白表达。这些结果表明，PNU通过α7 nAChRs上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白与PI3K/Akt信号通路的激活相关。上调Akt能对抗Aβ诱导的神经元凋亡和tau蛋白磷酸化〔21〕。PNU处理星形胶质细胞后能明显抑制Aβ的聚集，并且该作用能被LY294002阻断，说明PNU通过α7 nAChRs抑制Aβ聚集与PI3K/Akt信号通路的激活相关，而且该过程可能有内源性Cryab蛋白的参与。因为在AD大脑中，星形胶质细胞表达的Cryab蛋白明显上调，并且这些上调的Cryab蛋白紧密地分布在Aβ蛋白沉积周围〔7〕。Cryab蛋白能够通过与Aβ蛋白直接结合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其细胞毒性作用〔8〕。

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〔2016-05-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

PNU inhibiting Aβ aggregation via upregulation endogenous Cryab in rat astrocytes

REN Zhen-Kui,YANG Mei,GUAN Zhi-Zhong,et al.

Key Lab of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the possible mechanism of PNU on amyloid β (Aβ)aggregation via activation α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab.Methods Primary culture astrocytes were separated from neonatal SD rat cerebral cortex;Aβ1-42oligomers were prepared in vitro.Astrocytes were divided into control,PNU,MLA,Aβ1-42,PNU + Aβ1-42,PNU + LY294002 + Aβ1-42groups.The protein levels of Cryab,phosphorylated-Akt (ser473)and Aβ oligomers in the cells were detected by Western blot.Results (1)PNU significantly increased endogenous Cryab in astrocytes(P<0.05).The effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA (P<0.05).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited(P<0.01).(2)PNU significantly increased phosphorylated-Akt in astrocytes (P<0.05).The effect of up regulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA(P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited (P<0.01).(3)In cell lysis solution and medium,PNU significantly enhanced astrocyte to inhibit Aβ aggregation (P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of inhibition Aβ aggregation by PNU was significantly inhibited(P<0.01).Conclusions PNU could significantly inhibit Aβ aggregation via activated α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab in astrocytes.PI3K/Akt signaling pathway is likely to be invoved in this process.

Astrocytes;Alzheimer’s disease;α7nAChRs;PNU;αB-crystallin;β-amyloid

国家自然科学基金(81360199)；教育部科学技术研究项目(213032A)；贵州省国际科技合作计划项目(黔科合外G字〔2013〕7026号)；贵州省教育厅项目(2015年贵州省普通高等学校地方病和少数民族疾病防控创新团队)

禹文峰(1971-)，男，教授，主要从事神经分子生物学研究。

任真奎(1988-)，男，硕士，主要从事神经分子生物学研究。

R34

A

1005-9202(2016)22-5506-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.006