李渡酒业元代古窖与新窖窖泥微生物的比较研究

汤向阳,陈金魁,朱栋才,李新社,肖长元

(1.江西李渡酒业有限公司,江西 南昌331725；2.邵阳学院生物与化学工程系,湖南 邵阳 422000)



李渡酒业元代古窖与新窖窖泥微生物的比较研究

汤向阳1,陈金魁2,朱栋才1,李新社2,肖长元2

(1.江西李渡酒业有限公司,江西 南昌331725；2.邵阳学院生物与化学工程系,湖南 邵阳 422000)

以江西李渡酒业有限公司元代古窖与新窖窖泥为研究对象,对窖泥微生物种类与数量、窖泥理化指标及窖池原浆酒理化指标进行比较研究。研究结果显示：元代古窖窖泥中细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等主要功能菌种类与新窖基本一致,但数量均多于新窖窖窖泥；窖泥水分含量、窖泥总磷和钾含量随着窖龄的增加有上升的趋势,窖泥腐殖质含量随着窖龄的增加有下降的趋势,两窖窖泥 pH 值均为弱酸性；元代窖池原浆酒的酒精度、总酸、总酯含量高于新窖池原浆酒,而固形物含量低于新窖池原浆酒。研究结果表明,窖池窖龄对大曲酒风味和品质有一定影响,老窖出好酒的根本原因是随着窖龄的增长,功能菌的数量和种类增加,产生的风味物质和香味物质更多,生产的大曲酒品质更优。

窖泥；微生物；功能菌；原浆酒；理化指标

窖池是中国白酒特色发酵容器,窖池窖泥质量影响白酒质量。自然老熟的窖泥是历经几年甚至上千年转化积累而成,窖泥中的微生物不断演变,酒糟中的物质互相渗透,香味物质,营养物质等成分的持续累积以形成优质老窖泥,是微生物生长和富集的温床,因此窖泥微生物对大曲酒产量和质量起着至关重要的作用[1～2]。窖泥中的细菌主要有乳酸菌、丁酸菌、己酸菌、甲烷菌、丙酸菌[3]等；霉菌主要有根霉,曲霉,毛霉等[4]；酵母菌主要有酒精酵母,汉逊氏酵母,假丝酵母[5]等；放线菌主要有链霉菌,诺卡氏菌,小单孢菌等[6]。

对于窖泥微生物的研究,主要集中在窖泥微生物区系分析、功能菌鉴定及窖泥微生物功能菌对酒质的影响：施安辉[7]对浓香型酒窖中微生物随发酵过程中微生物的变化情况,从入窖至出窖窖泥中微生物区系分析的结果说明,窖泥中的好氧细菌和厌氧细菌均随发酵时间的延长而有规律地变化。吴飞[8]对沪州窖池与全兴窖池中酵母菌的变化情况作了研究,结果表明,发酵工艺对微生物消长情况有较大的影响。从优势菌群来看,每个窖池都有各属的酵母优势菌群,但是各个窖池中分布的优势菌又有所差异。白酒微生物是形成白酒香型的一个重要因素,它在白酒酿造过程中发挥着重要的作用,即白酒微生物影响着白酒的香味和风格。白酒微生物区系研究表明在浓香型酒曲中细菌总数高于酱香型酒曲,而酱香型酒曲中的芽孢菌总数高于浓香型酒曲,另外浓香型酒曲中的产酸菌,分解菌高于酱香型酒曲。王治国等[9]在应用产醋酵母提高浓香型白酒质量的研究中指出,浓香型白酒中应用产醋酵母,对己酸醋化成己酸乙醋有促进作用而且可以大幅度提高乙酸乙醋的含量;当产醋酵母和己酸菌液混合使用时,可以较大的提高己酸乙醋的含量,而且可以相对降低乳酸乙醋的含量。张付旺等[10]研究发现,由于丙酸菌具有分解乳酸的特性,因此当将丙酸菌应用到白酒发酵中时,白酒中的乳酸和乳酸乙醋的含量降低而且己酸乙醋含量增加,提高了酒体的风味,取得了非常显著的效果。乳酸菌在白酒发酵过程中有着重要的作用,研究表明它对美拉德反应有促进作用,而且维持发酵环境的偏酸性,有利于糖化和发酵的顺利进行。另外乳酸菌产生的代谢产物乳酸是乳酸乙醋及其他香味成分的重要前提物质。 吴飞等[[11]从发酵7d的浓香型白酒发酵酒醅中分离到84株酵母菌,通过形态特征、生理特性检测及18SrDNA分子生物学水平鉴定方法将其归为6个类群,并建立系统发育树。结果表明,样品酒醅中可培养酵母以伊萨酵母属和毕赤酵母属为主,得巴利酵母属和假兹酵母属也占有相当的比例,其中还有一定数量的其他属种,如酵母属和红酵母属。张文学等[12]为探索中国浓香型白酒发酵糟醅中细菌类微生物区系的形成和演变规律,通过发酵全过程跟踪取样和借助PCR扩增技术,对窖池中心糟醅样品进行了DGGE分析和16SrDNA同源性比较。研究发现,11个以上的细菌分类属;随着发酵的进行,Lactobacillus属细菌成为主要优势菌,检出的有效克隆达到全部克隆的56.1%,并全部为Luc.Acetotolerans(98%)菌株。主要细菌菌群的数量分布及变化趋势显示,在浓香型白酒糟醅发酵过程Lactobacillus属细菌可能充当着重要的角色。

本研究旨在对李渡酒业元代古窖与建于上世纪八十年代的新窖窖泥微生物进行比较研究,以探究大曲酒品质与窖泥质量之间的联系,为老窖出好酒提供科学理论依据,为李渡酒业发酵生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

窖泥：采自李渡酒业32#元代古窖与李渡酒业新窖(建于二十世纪八十年代)

原浆酒：李渡酒业元代古窖与新窖原浆酒由李渡酒业提供。

试剂：硝酸、亚硝酸钠(天津鹏坤化工有限公司);硝酸钾、硝酸钴(广州市榕晟化工有限公); 硫酸、高锰酸钾(南京化学试剂有限公司); 草酸钠、重铬酸钾、氢氧化钠(天津鹏坤化工有限公司);邻啡罗啉(沈阳金天源化工有限公司);蛋白胨、胰蛋白胨(生工生物工程股份有限公司);牛肉膏、酵母膏(上海生化试剂抚生有限公司);葡萄糖、琼脂(武汉万荣科技发展有限公司);柠檬酸氢二铵、氯化钙(浙江大成钙业有限公司);氯化钴(上海芃硕生物科技有限公司)。

培养基：包括细菌培养基；酵母菌培养基；霉菌培养基；放线菌培养基。配制各微生物特征培养基,参照GB4789.2-2010 《食品微生物学检验 菌落总数测定》规定的方法进行。

1.1.2 主要仪器设备

MBMJ-78A高压蒸汽灭菌锅(北京东西仪科技有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京市光明医疗仪器厂)；HPX-9272MBE恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；标准单人型超净工作台(浙江苏净净化设备有限公司)；菌落计数器(无锡久平仪器有限公司)等。

1.2 检测方法

1.2.1 样品采集及预处理

选取窖池四壁和窖底中央五点进行窖泥取样。取样后及时进行感官评定、水分含量检测及微生物数目检测；剩余样品自然风干后粉碎、100目过筛,用于腐殖质、有效钾和有效磷等的检测。

1.2.2 微生物种类与数量检测

配制各微生物特征培养基,参照GB4789.2-2010 《食品微生物学检验 菌落总数测定》规定的方法进行：

窖泥样液制备(25g+225ml无菌水)→窖泥稀释液的制备(十倍稀释法)→平板涂布分离(做3个连续的稀释度,每稀释度做2-4套平行平板,真菌培养需加细菌抑制剂)法→培养箱适温培养至生长完全→计数→挑取菌落编号后划线纯化→纯种移接斜面保存备用。

1.2.3 窖泥理化指标测定方法[13]

(1)水分的测定：采用恒重法[14];(2) PH测定：采用PH计法[15];(3)有效磷测定：浸提—钼锑4抗比色法[16];(4)腐殖质的测定：采用焦磷酸钠提取重铬酸钾法[17]。

1.2.4 原浆酒理化指标检测方法

(1)总酸的测定：采用中和滴定法[18];

(2)总脂的测定：采用氢氧化钠滴定法[19];(3)酒精度的检测：采用酒精计测定法[20];(4)酒精中固形物检测：采用恒重法[21];

2 结果和分析

2.1 窖泥中微生物检测

2.1.1 窖泥中主要微生物类群检测

分别配制细菌、酵母菌、霉菌、放线菌常规培养基,灭菌后倒平板备用。将窖泥样品制成样液,进行十倍稀释后,采用平板活菌计数法,检测窖泥中微生物数,结果见表1。

表1 窖泥中主要微生物类群检测结果(cfu/g)

由表1可知,元代古窖窖泥四大主要微生物类群数量均多于新窖窖泥。这主要是由于随着窖龄的增加,窖池中的环境更加有利于微生物的生长繁殖以及演变演化,微生物逐渐富集的结果。元代古窖窖泥中细菌总数高于新窖窖泥,因而能产生更多的酸类和香味物质。元代古窖窖泥霉菌略多于现代窖泥,使古窖窖泥的糖化能力更强,可产生更多的形成大曲酒风味的物质。元代古窖窖泥酵母菌高于现代窖泥,更有利于酒精的产生。相对而言,老窖与新窖放线菌数量差异小,是因为放线菌为好氧菌,新窖窖龄短,窖泥中氧气和营养成分比较充足,有利于好氧菌的生长、繁殖。

2.1.2 窖泥中主要微生物种类与数量检测

分别配制乳酸菌、己酸菌、甲烷菌、丙酸菌、丁酸菌、酒精酵母、汉逊氏酵母、假丝酵母根霉、曲霉、毛霉、链霉菌、诺卡氏菌、小单孢菌的特征性培养基,灭菌后倒平板。将窖泥样品经十倍稀释后,采用平板活菌计数法,检测各菌的数量,结果见表2。

表2 窖泥中主要微生物检测结果(cfu/g)

从表2中可以看出,元代古窖窖泥中被检酵母菌的数量均比新窖窖泥多。由于酵母菌在发酵过程中,主要进行的是酒精发酵,酒精含量越高,能溶解的风味和香味物质更多,酿造的大曲酒的品质更加优良。元代古窖窖泥中乳酸菌、己酸菌、丁酸菌等功能菌显著高于新窖窖泥。丁酸菌、己酸菌生长在窖泥中,利用酒醅浸润到窖泥中的营养物质产生丁酸和己酸；乳酸菌能发酵酒醅内糖类产生乳酸,乳酸通过酯化产生乳酸乙酯且乳酸菌具有酿酒的发酵、维护与保持酿酒微生态环境等作用。元代古窖窖泥中的各被检霉菌数量比新窖窖泥多。由于霉菌在大曲酒酿制过程中会产生多种酶,能促进发酵进程,并参与发酵风味物质的形成,因而影响大曲酒的出酒率和质量。在一定程度上霉菌数量越多,出酒的品质也就越好。元代古窖窖泥中的放线菌多于新窖窖泥。在白酒发酵初期,放线菌可以分泌产生淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等,作用于酒醅中的淀粉、蛋白质及纤维素等,生成各种氨基酸类及糖类物质,为发酵产酒、产香提供前体物质。随着放线菌的数量增加,酿造过程中形成的风味和生香物质更多,在一定成度上影响酒的品质。

2.2 窖泥理化指标检测

2.2.1 窖泥的感官检测及窖泥的理化指标检测

从色泽、气味、手感等方面对元代古窖与新窖窖泥进行感官评价；指标[22]。随机选取20人对两窖窖泥根据评价标准进行量化打分,最后计算出平均值。采集两窖窖泥样品,对其中的水分含量、pH值、腐殖质、有效钾、有效磷等指标进行检测,结果见表3。

表3 窖泥的感官检测及窖泥的理化指标检测结果

由表3可知,新窖窖泥呈黄褐色,无投入原料本色,有窖泥酯香、酒香味,略有生味,无其它异杂味,有明显刺手感,窖泥质地较为均匀,掺有少许杂质,稍有粘稠感。元代古窖窖泥呈灰褐色,闻之略有酯香、酒香,无其它异杂味,手感柔熟细腻,质地均匀无杂质,有粘稠感,各项感官指标显示,基本符合优质窖泥的标准。新窖窖泥的水分含量明显高于元代古窖窖泥,pH略高于元代古窖窖泥,而优质窖泥的含水量在45%～55%,元代古窖窖泥更符合优质窖泥的标准。随着窖龄的增长,各类物质的积累量增多,有机质和各种元素的量也增加,元代古窖窖泥中的腐殖质、有效钾、有效磷均高于新窖窖泥,其构成的物质环境更有利于各类微生物生长和合成各种风味物质。

2.3 原浆酒理化指标检测

分别采集元代古窖与新窖窖池酿制的原浆酒样品,对它们进行酒精度、总酸、总酯及固形物含量检测,结果见表4。

表4 原浆酒理化指标检测结果

由表4可知,元代古窖酿出的原浆酒酒精度、总酸、总酯含量均高于新窖酿出的原浆酒,而固形物含量则低于新窖酿出的原浆酒。这是由于元代古窖窖泥中酒精酵母略多于现代窖泥,故其产生的酒精量稍高,因此其原浆酒的酒精度略高于新窖酿出的原浆酒。元代古窖窖泥中乳酸菌、己酸菌、丁酸菌等产酸功能菌高于新窖窖泥,故而其原浆酒总酸更高。由于元代古窖窖泥中产酸、产醇微生物数目较新窖窖泥多,因此,形成的酯类芳香物质也更多。新窖窖泥相对而言不够成熟,在发酵过程中生成过多的乳酸、乙酸等酸类物质,易在之后的生产加工过程中形成固形物,因此新窖原浆酒的固形物含量高于元代古窖的原浆酒。

3 结论

(1)两窖窖泥的微生物种类没有差异,差异在于微生物数量,表现为元代古窖窖泥待检微生物数量均多于新窖窖泥.

(2)元代古窖窖泥呈灰褐色,有酯香、酒香,无其它异杂味,手感柔熟细腻,质地均匀无杂质,有粘稠感,达到优质窖泥的标准；现代窖泥呈黄褐色,有窖泥酯香、酒香味,略有生味,无其它异杂味,有元显刺手感,窖泥质地较为均匀,掺有少许杂质,稍有粘稠感,窖泥感官指标不及元代窖泥。

(3)元代古窖窖泥腐殖质、有效钾、有效磷含量高于新窖窖泥,而水分、pH值低于新窖窖泥。表明,窖泥水分含量随着窖龄的增加有下降的趋势；不同窖龄窖泥 pH 值均为弱酸性；窖泥腐殖质含量随着窖龄的增加有上升的趋势。

(4)元代窖池原浆酒的酒精度、总酸、总酯含量高于新窖窖池原浆酒,而固形物含量则低于新窖窖池原浆酒。

因此,老窖出好酒的根本原因是功能菌的数量和种类。随着窖龄的增长,窖泥中的有机物和各种元素含量增多,有利于各种微生物的生长繁殖,微生物种类和数量随之增加,微生物的丰富度更高,各类微生物相互协作,形成成熟稳定的微生物区系,产生大曲酒风味和香味的物质更多,从而生产的大曲酒品质更优。通过检测比较两窖窖泥及原浆酒的理化指标,也充分印证了这一理论。

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Comparison of the pit mud microorganisms between Yuan dynasty old cellar and new cellar from Li Du wine Co.,Ltd.

TANG Xiangyang1,CHEN Jinkui2,ZHU Dongcai1,LI Xinshe2,XIAO Changyuan2

(1.Jiangxi Li Du wine Co.,Ltd,Nanchang Jiangxi 331725；2.The Department of Biology and Chemistry Engineering,Shaoyang University,Shaoyang ,Hunan 422004)

The pit mud of Yuan Dynasty old cellar and new cellar from Li Du wine Co.,Ltd were studied and compared.The number and species of microbes in pit mud,the physicochemical index of pit mud and the physiochemical indexes of the wine were compared.The results showed that: the main functions bacteria in the pit mud of the Yuan Dynasty were basically the same with the new cellar,but the number was more than that of the new pit mud.The content of water,K,P in pit mud increased and the content of pit mud humus decreased with the increase of age.The pH value of the two pit mud was weak acidity.The content of alcohol,total acid,total ester of Yuan Dynasty pits protoplasmic wine was higher than that of new pits protoplasmic wine and the content of solid is lower than that of the new pits.It showed that the pit age has a certain effect on the flavor and quality of liquor,with the cellar age growth,the number and variety of functional bacteria are increased and more flavor and flavor substances are produced,there,the quality of the wine is better.

pit mud;microorganism;functional bacteria;protoplasmic wine;physicochemical index

1672-7010(2016)03-0102-06

2016-05-18

湖南省科技厅科技计划项目(CX2015B603)；邵阳学院研究生科研创新项目(CX2015SY008)

汤向阳(1968-)，男，江西李渡酒业有限公司董事长，从事生态酿酒研究

李新社(1965-),女，教授，硕士，从事应用微生物教学与研究，E-mail：625959218@qq.com

TS262.3；TS261.1

A