克雅病的分子诊断

罗生辉 蔡继勇

·综述·

克雅病的分子诊断

罗生辉 蔡继勇★

克雅病（creutzfeldt-jakob disease，CJD）是一种神经系统退行性疾病，临床少见，其早期诊断较困难。目前诊断CJD的分子手段有3种：免疫组织化学、基因检测及脑蛋白标志物。免疫组织化学法发现异常朊蛋白是确诊的金标准，但是很大部分患者生前无法接受脑组织的免疫组织化学检查；基因检测可对CJD的分型及家族性CJD的诊断提供依据，但不是所有朊蛋白基因突变均会导致CJD；脑蛋白标志物的检测在临床上较实用，但所有脑蛋白标志物均有特异性的缺陷。本文旨在总结CJD在分子水平上的研究结果及进展。

克雅病；朊蛋白；朊蛋白基因；14-3-3蛋白；Tau蛋白

克雅病（creutzfeldt-jakob disease，CJD）是人类最常见的朊蛋白病，为神经系统退行性疾病，病理基础是神经细胞的朊蛋白空间构象发生变异，出现一种可自我复制并对蛋白激酶抵抗的异构体。该病临床分为散发性CJD、遗传性CJD、医源性CJD 3种。散发性CJD是最常见的类型，约占人类所有朊蛋白病的85％，年发病率在（1～2）/1 000万［1］。该病表现为快速进行性的认知功能障碍、肌阵挛、视觉障碍、小脑性共济失调、锥体束和锥体外系征、无动性缄默等。分子水平的检查在CJD的诊断中起到决定性的作用，脑组织病理检查是确诊的金标准。但是在我国，大部分患者在生前无法接受病理检查，死后家属愿意接受尸检的也很少。朊蛋白基因检测可解释CJD的临床表现及个体对异常朊蛋白的易感性，脑蛋白标志物的检测是临床常用的诊断CJD的依据之一。本文将从蛋白质、蛋白标志物和基因3方面总结CJD在分子水平的诊断进展。

1 异常朊蛋白检测

正常脑组织存在少量的朊蛋白（normal cellular isform of the prion protein，PrPc），是一种单基因编码的膜结合性糖蛋白，呈α螺旋结构。异常的朊蛋白（protease-resistant prion protein，PrPsc）为朊蛋白的异构体，呈β片状结构，CJD是PrPsc在脑内沉积所致［2］。

1.1 从脑组织中检测

异常朊蛋白主要沉积在患者的脑组织中，取活检或尸检患者的脑组织，匀浆后用蛋白酶K（proteinase K）消化，异常朊蛋白不能被蛋白酶K完全消化，用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）或蛋白免疫印迹杂交（Western blot）等方法检测消化后的产物，若仍有朊蛋白，就可以诊断为朊蛋白病［3］。有学者［4］应用构像依赖性免疫测定（conformation-dependent immunoassay，CDI）方法检测CJD患者的异常朊蛋白，发现异常朊蛋白在人体内的分布是不均匀的，并且有可能存在对蛋白酶K敏感的异常朊蛋白。

1.2 从外周组织中检测

外周组织取材较容易，损伤小，因此从外周组织检测异常的朊蛋白是很好的研究方向。Rubenstein等［5］总结了异常朊蛋白在人体中的分布，发现不论是散发性CJD还是变异性CJD，异常朊蛋白的水平在非中枢神经系统的人体组织（脾，淋巴结，扁桃体）没有显著差异。但是从外周组织中检测朊蛋白的检出率低，应用于临床检测还需进一步研究。

虽然脑组织病理检查是金标准，但是脑组织标本不易获得，临床上很难实行，导致很多患者无法被早期诊断；外周组织虽然容易取材，但诊断的阳性率较低。

1.3 从体液中检测

比外周组织更易获得的是患者的体液或外周组织的刷洗液。在临床上，血液、尿液、唾液、脑脊液等体液较容易获得。如果能利用体液检测异常朊蛋白，可极大的方便CJD的早期诊断，但是异常朊蛋白在这些体液中的含量均很低，利用专统方法检测的敏感性很差，因此很多学者应用许多方法提高检测的敏感性。研究者［6］运用共聚焦双色荧光关联分光镜法（confocal dual-color fluorescencecorrelation spectroscopy，dual-color FCS）从CJD患者脑脊液中检测到了PrPsc。随着技术的发展，各种新的方法也被利用，利用朊蛋白错误折叠循环扩增技术（protein m is folding cyclic amplification，PMCA）可从临床前期的绵羊口腔分泌物中检测出异常的朊蛋白［7］，近几年实时震动诱导转化（real-time quaking-induced conversion，RT-QUIC）技术也显示出很大的应用价值。2011年，Atarashi等［8］首次报道应用RT-QUIC技术扩增检测异常的朊蛋白，从而提高了应用脑脊液检测异常朊蛋白的敏感性。而后也有研究者［9］应用该技术获取CJD患者的鼻黏膜刷洗液检测异常的朊蛋白，获得很高的灵敏度及特异度（灵敏度97％，特异度100％）。而Peden等［10］的研究表明，应用该方法检测散发性CJD患者的脑脊液有很高的敏感性，但是对变异性CJD敏感性不高。

但是，异常朊蛋白在体液中的含量低，利用各种扩增的方法虽然可提高检测的敏感性，但不可避免的会出现假阳性的情况。因此，要将上述检测方法应用到临床尚需经过大宗样本的检测，确定有较好的特异性和可重复性之后方可应用。

2 脑蛋白标志物检测

异常朊蛋白是朊蛋白病的特异性蛋白，临床上检测到异常朊蛋白是确诊朊蛋白病的必要条件。异常朊蛋白的检测较困难，研究者们试图找到可代替异常朊蛋白的脑蛋白标志物。

2.1 14-3-3蛋白和Tau蛋白检测

14-3-3蛋白在神经系统中含量最丰富，约占全部可溶性蛋白质的1％，所有神经细胞的胞液与胞核中都有表达［11］。Tau蛋白主要在中枢神经系统神经元的轴突表达，存在于星形胶质细胞和少突胶质细胞内，在外周神经系统的神经元轴突也有表达。

1998年的世界卫生组织将14-3-3蛋白列入诊断CJD的标准，但14-3-3蛋白在不同分子亚型中变异很大，129密码子基因型、朊蛋白类型、疾病所在分期、临床亚型均会影响14-3-3蛋白含量和检测的敏感性［12］，且14-3-3蛋白在特异性方面也有缺陷。近年来有许多研究发现Tau蛋白优于14-3-3蛋白，Ham lin［13］和Tagliapietra等［14］对MRI、14-3-3蛋白和Tau蛋白的对比发现，Tau蛋白的敏感性和特异性优于14-3-3蛋白。在遗传性CJD的研究中，以色列研究人员［15］发现，Tau蛋白与14-3-3蛋白在敏感性方面没有区别，但Tau蛋白的特异性更高。中国疾病预防控制中心的研究员曾对200例很可能的CJD患者的脑脊液分析发现，CJD患者脑脊液Tau蛋白升高，以脑脊液Tau蛋白含量1 400 pg/m L为分界点，其诊断CJD的敏感性是90％，特异性是94％［16］。

2012年美国的指南仍推荐14-3-3蛋白作为散发性CJD的诊断标志物［17］，Tau蛋白是否能取代14-3-3的蛋白地位还没有结论，但研究表明联合检测这2种标志物可提高敏感性及特异性［18］。

2.2 胸腺素β4蛋白

研究者［19］通过检测21例病理确诊的CJD患者的脑脊液的胸腺素β4蛋白，发现用其诊断CJD的灵敏度为100％、特异度为98.5％。然而该标志物的应用价值仍需进一步研究。

2.3 其他蛋白标志物

S100蛋白及神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）等蛋白标志物由于特异性差，已没有研究价值。一些标志物如心型脂联合蛋白（heart-type fatty acid binding，H-FABP）［20］、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）［21］、泛素（ubiquitin）［22］有待进一步研究。

脑脊液蛋白标志物的检测是目前CJD诊断必要检查，也是曾经研究的热门，但特异性差是该类蛋白标志物共有的缺点，随着外周组织及体液异常朊蛋白检测技术的深入研究，脑脊液蛋白标志物的检测在CJD的诊断中的地位也将动摇。

3 基因检测

正常的朊蛋白由位于第20号染色体短臂上的朊蛋白基因（prion protein gene，PRNP）编码［23］。脑组织出现PrPSc的原因有自身PRNP突变、PRNP翻译错误或感染了外源的PrPSc所致。人类PrP基因存在着多态性，它影响人类对于散发性、遗传性或是医源性CJD的易感性。129位点纯合子较杂合子更易感染朊蛋白。不同位点的基因突变会导致不同类型的CJD，其临床表现也不一样。

3.1 散发性CJD检测

散发性CJD约占人类朊蛋白病的85％［1］。散发性CJD有不同的临床变异型。在CJD的临床症状和体征、异常朊蛋白的物理化学特征、异常朊蛋白在脑内损害的部位和沉积的形式上，不同临床表型有不同表现，表型的不同在很大程度上取决于PrP基因129密码子位点上甲硫氨酸（methionine，M）和缬氨酸（valine，V）的多态性和异常朊蛋白的分子量。根据朊蛋白的糖基化程度不同可有2种分子量：第1种分子量为20（20.5±0.3）kD，为朊蛋白株1型（type 1）；第2种分子量为19，（18.7± 0.2）kD为朊蛋白株2型（type 2）。有学者［24］根据PrP基因129位点密码子的多态性和异常朊蛋白的物理化学特征，把散发性CJD分成6型。研究表明，219密码子的多态性与CJD无明显作用［25］。3.2遗传性CJD检测

遗传性CJD占CJD的5％～15％［1］，是常染色体显性遗传病，通常都有CJD的遗传史，与20号染色体短臂上的PrP基因突变相关。其中最常见的疾病相关突变是第102位密码子和第200位密码子突变。目前发现的，国外学者报道的可导致CJD的突变位点有178、129、183、211、180，国内学者有报道114、180、196、203密码子突变的家族［26-29］，扩大了CJD的PRNP基因突变谱。

3.3 医源性检测

是由于患者接受了医学治疗后感染异常朊蛋白所致，医源性途径主要有角膜移植、硬脑膜移植、注射人生长因子及促性腺激素以及使用被污染的深部电极等［30］。在对41例因注射受污染的人类生长激素或促性腺激素后患CJD的患者进行朊蛋白基因129密码子的分析中发现，21例是129密码子甲硫氨酸纯合子，17例为缬氨酸纯合子，3例是甲硫氨酸/缬氨酸杂合子；12例与硬脑膜移植有关的CJD病例的129密码子全部是甲硫氨酸纯合子［31］。结果表明，129密码子是纯合子更易感染异常朊蛋白。

4 小结与展望

由于CJD的发病率低，国内神经科医生对CJD的了解不足，CJD的诊断率不高。随着国内神经科医生对该病的认识不断加强，CJD的诊断率也会增加。在诊断CJD的脑脊液神经蛋白质中，14-3-3蛋白是最有价值的脑神经蛋白；脑组织病理检查及异常朊蛋白的检测敏感性及特异性最好，但取材困难；外周组织及体液取材容易，但检测的敏感性差。随着技术的进步，体液及外周组织的刷洗液的异常朊蛋白检测有可能在CJD的早期诊断中起到至关重要的作用。

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The molecular diagnosis of creutzfeldt-jakob disease

LUO Shenghui，CAIJiyong★
（Department of Neurology，The First Hospital of Fuzhou City（the Affiliated Hospital of Fujian Medical University），Fuzhou，Fujian，China，350009）

Creutzfeldt-jakob disease（CJD）is a rare neurodegenerative disorder.The diagnosis of it is extremely difficult in its early stages.There are 3 diagnostic methods at the molecular level: immunohistochemistry，gene detection，and measurement of brain protein biomarkers.A definite diagnosis of CJD is obtained following the demonstration of the pathologic prion isoform in brain tissues，but a substantial proportion of the cases are not subjected to neuropathology.Although gene detection can provide a basis for the typing and the diagnosis of CJD，not all of the prion protein gene mutation will lead to CJD.The detections of brain protein biomarkers are relatively practical clinically，but all of the brain protein markers are with specific defects.In this paper，the research results and progress of CJD at the molecular level will be summarized.

Creutzfeldt-jakob disease；Prion protein；Prion protein gene；14-3-3 protein；Tau protein

福建医科大学附属福州市第一医院神经内科，福建，福州350009

蔡继勇，E-mail：15736973@qq.com