地中海贫血产前遗传筛查流程简化的风险评估

肖奇志 李恋湘 谢建红 李磊 王格 张婧惟 龙若庭 周玉球

·论著·

地中海贫血产前遗传筛查流程简化的风险评估

肖奇志 李恋湘 谢建红 李磊 王格 张婧惟 龙若庭 周玉球★

目的评估全血细胞分析（fullblood count，FBC）结合常见地中海贫血（简称地贫）基因检测（简称两步法）取代传统的FBC结合血红蛋白（hemoglobin，Hb）分析和地贫基因检测（简称三步法）用于地贫产前遗传筛查的可行性。方法采用回顾性分析的方法，对近2年（2014年1月1日至2015年12月31日）珠海市产前门诊6 291名孕妇及其配偶FBC、Hb分析和地贫基因检测的结果采用x2检验进行统计学分析，比较两步法和三步法在产前地贫遗传筛查中的可靠性及经济性。结果以经典的三步法作为标准，两步法对孕妇及其配偶地贫检测的灵敏度、特异性、阴性预测值和阳性预测值以及总的诊断效率分别为98.25％、99.52％、85.98％、88.12％、91.23％，两步法对血红蛋白H（hemoglobin H，Hb H）病、轻型β-地贫、异常Hb和δβ-地贫/遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的漏检率分别为2.59％（2/77）、0.01％（2/1 695）、8.78％（13/148）和48.30％（43/89）。结论产前地贫遗传筛查流程中采用三步法有其科学性，既可避免Hb H、异常Hb以及δβ-地贫/HPFH等个体的漏检，还可为地贫DNA诊断指明方向。在未建立覆盖中国人异常Hb病基因谱的分子筛查技术之前，两步法暂不能取而代之。

地中海贫血；遗传筛查；表型-基因型；血红蛋白变异体

地中海贫血（简称地贫）是一组由于珠蛋白基因缺失或功能障碍导致珠蛋白链缺失或合成不足所引起的遗传性溶血性血液病，为中国南方各区的常见病和多发病［1］，严重类型地贫可致死或致残，该病易防难治，目前已成为热带和亚热带地区一个重大的公共卫生问题。为此，2013年2月珠海市启动了免费地贫干预项目并在具有地贫研究基础和大人群预防控制经验［2］的珠海市妇幼保健院建立了市级地贫筛查管理办公室和市级地贫诊断中心，负责协调、管理、督导全市产前地贫的遗传筛查、接收和检测珠海市其他36家医疗保健机构转送的初筛阳性标本［平均红细胞血红蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）小于27 pg或/和平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）小于82 fL］并负责严重类型地贫高风险胎儿的产前诊断和跟踪随访。由于地贫遗传筛查的网点多且分散，临床实验室的水平又参差不齐，加之标本转运的环节多和时间长，经常出现送检标本发生溶血现象，严重影响血红蛋白（hemoglobin，Hb）分析的准确度。为此，本研究拟采用全血细胞计数（fullblood count，FBC）结合地贫基因诊断（简称“二步法”）替代世界地贫联合会推荐的FBC结合Hb分析和地贫基因诊断［3-4］（简称“三步法”）以简化地贫遗传筛查技术流程，并以三步法作为标准，以评估其可行性和可能存在的技术风险。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2014年1月1日至2015年12月31日珠海市37家产科服务机构送检的地中海贫血筛查标本共6 291对，排除了仅检测孕妇或配偶一方的未配对标本。所有标本均于抽血当天在全市37家产科服务医疗机构进行血细胞分析。夫妻双方中只要一方红细胞指数异常（MCV＜82 fL或/和MCH＜27 pg）即纳入地贫初筛阳性夫妻，填写相关资料并将夫妻双方标本转运至珠海市地贫诊断中心进行统一检测。

1.2 血红蛋白分析

采用美国Bio-Rad生产的仪器、配套试剂和质控品，按照说明书进行操作，并按照Hb各组分的洗脱时间初步进行异常血红蛋白的鉴定。

1.3 常见α-地贫突变的检测

所有标本采用单管多重PCR法和反向点杂交法［5］分别检测中国人4种常见的缺失型（--SEA，-α4.2，-α3.7，--THAI）和3种非缺失型（αCS、αQS和αWS）α-地贫突变。α-地贫基因检测试剂盒分别由深圳益生堂生物企业有限公司和亚能生物技术（深圳）有限公司生产，严格按照其提供的使用说明书进行操作、质量控制和结果判断。PCR仪为Bio-Rad CFX96产品，分子杂交仪则由美国Robbin Scientific公司生产。

1.4 常见β-地贫点突变的检测

采用反向点杂交法和探针熔解曲线法分别检测中国人常见的17种和23种β-地贫突变［6］，试剂盒分别由深圳益生堂生物企业有限公司和厦门致善生物科技有限公司生产。所用设备同上。

1.5 少见类型地贫和异常血红蛋白基因检测

对于地贫表型阳性和/或有异常血红蛋白表型但未检出常见地贫型，δβ-地贫和遗传性持续性胎儿血红蛋白（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）综合征的孕妇及其配偶，则将其标本送至深圳华大基因公司做进一步DNA测序法以明确诊断。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。对于试验诊断评价指标，以三步法作为标准，分别计算二步法的灵感度、特异度、阴性预测值和阳性预测值和总的诊断效率，并采用x2检验比较两组间各诊断指标之差异，以α=0.05为水准，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 Hb分析的结果

从上述所送检的标本中，Hb分析检测阳性特征性结果中有：快泳带；慢泳带；血红蛋白A2（Hb A2）≥3.5％（β-地贫特征）；血红蛋白F（Hb F）升高（≥2.0％）等，分类详见表1。

表1 Hb分析的结果Table 1 The results of hemoglobin analysis

2.2 两步法与三步法检测结果的比较

由于检测和内容方式一样，二步法和三步法对于疑为α-地贫特征和红细胞指数正常个体的诊断效率均完全相同，但在检测如下3类标本时，则容易出现漏检：Hb变异体时（包括Hb快泳带和慢泳带）；（Hb F≥2.0％但Hb A2＜3.5％）即表型为δβ-地贫/HPFH和少见类型β-地贫特征，具体结果详见表2。

表2 二步与三步检测法结果的比较Table 2 The results of two-step method compared with that of three-step method

2.3 两步法与三步法检测结果对筛出严重类型高风险胎儿的影响

在上述6 291对孕妇及配偶中，二步法和三步法均筛出146个α-地贫高风险胎儿，但二步法只检出47个高风险重型β-地贫胎儿中的46个（97.87％）（χ2=1.01，P=0.314），二步法漏检了其中一对夫妻，其中一方为轻型β-地贫，另一方为HbQ病，为稳妥起见，建议进行产前诊断。

2.4 两步法与三步检测法的成本和时间分析

两步法与三步法相比，省略了Hb分析这一步骤，需要对所有小红细胞症进行α-和β-地贫基因诊断，增加β-地贫基因诊断数量，整体费用和耗费时间详见表3。

3 讨论

产前筛查地贫一般遵循三步法原则：FBC是地贫初筛的第一关，Hb分析用于地贫表型初步分类和检测异常Hb区带［包括血红蛋白H（Hb H）］，而地贫基因诊断是对Hb分析后的标本进行有针对性地确定诊断或排除诊断，这也是经典的遗传病诊断模式。地贫仅属于血红蛋白病的一种，还包括异常Hb病和δβ-地贫及HPFH等，这些突变也影响血红蛋白的合成速率或质量，其某些类型与地贫复合也可能造成比较严重的影响，在临床实验室已经引起广泛关注［1，7］。

表3 两步法与三步法筛查的总费用与耗费时间比较Table 3 The total costand time of two-stepmethod compared with thatof three-stepmethod

在产前地贫筛查中三步法与两步法的区别在于是否进行Hb分析，它能定量分析Hb A2，Hb F，Hb H和异常Hb等成分，对进一步明确基因诊断方法，确定表型有指示作用。从12 582份标本来看，有阳性表征（FBC+Hb分析）的占58.89％（7 410/12 582），Hb分析有特征性阳性表征占16.04％（2 019/12 582），它能鉴定的主要特征性有：β-地贫、Hb H病、中间型β-地贫、异常Hb病和δβ-地贫/HPFH特征，各占比为13.49％、0.67％、0.01％、1.18％和0.70％。按两步法不进行Hb分析，漏检HbH病中的一种少见或罕见突变，漏检率为2.44％；漏检全部异常Hb病（包括单纯性Hb和合并地贫的异常Hb）；漏检全部HPFH及δβ-地贫；上述3种表型漏检总和占比为1.90％，总漏检率较低。由于地贫基因型检测为相同方法和技术，所以两步法与三步法差别在于漏检了2例HbH病中的一种少见或罕见突变和2例β-地贫特征者，导致最终判断不同。

在地贫遗传中夫妻双方同等重要，所以漏检分情况来看：如果漏检个体其配偶FBC正常，也排除携带常见地贫突变类型，即使有漏检情况发生，不产生严重后果，无需产前诊断，在地贫防控中不影响效果，本研究中占比为93.33％；如果漏检个体其配偶为地贫，特别是β-地贫，考虑到胎儿有机会携带β-地贫复合异常Hb病或复合HPFH及δβ-地贫，进行产前诊断较为稳妥，在本次研究中占6.67％。，当然除血红蛋白E（Hb E）外的其它异常血红蛋白病，在中国人群中的携带率很低，绝大多数合并地贫后很少加重临床表现，仅有一些个案报道［8-9］。总的来说2种方式的防控效果基本一致。

需要注意的是：无论是三步法还是二步法，均无法对表2中的146例疑似α-地贫标本进行突变的有效检出，在排除缺铁性贫血等其它导致小细胞低色素疾病的情况下，对存在地贫表型的标本进行更进一步检测，特别是夫妻一方为已知地贫，另一方有小细胞低色素症但未检测出已知突变，更要特别留意。

地贫防控作为公共卫生问题，财政的支付能力也需要考虑，如果三步法改为两步法，减少了Hb分析，但需对所有小细胞低色素的个体需要进行常见β-地贫基因突变检测，一方面增加了基因检测量，另一方也能最大限度避免β-地贫合并α-地贫个体的漏检。改变后整个预防控制费用下降10.54％，从李兵等［10-11］比较筛查的不同组合形式看，无论对α-地贫还是β-地贫地贫的筛查方案，传统三步法的费用都处于较高水平。另严重溶血标本对Hb分析有影响，而对基因检测没有影响。减少Hb分析，整个操作流程更畅通，预计整个检测时长下降25％，这对临床检测也工作非常重要。

临床上常见类型地贫基因检测技术经过多年的发展，在方法、技术、仪器和流程上都取得长足进步的时候，建立了许多高通量、全自动、快速、准确的实用临床应用技术，将异常Hb病和δβ地贫及HPFH相关基因整合到地贫相关基因突变谱中进行检测是可行的［12-13］。自动化核酸提取仪的应用助推分子诊断朝快速、高通量、高效的方向发展。

随着对地贫的认识进一步深入、地贫基因检测技术发展和覆盖突变谱的提升、核酸提取仪的广泛使用、高通量基因分析仪的推广和分子诊断试剂价格下降，为在地贫预防控制与诊断中全面采用分子诊断技术创造了有利条件。中山地区也采用了两步法进行试验［14］，香港地区的经验也验证了这一模式的有效性［15-16］。所以未来在大人群防控体系中采用二步法代替三步法是一种节约资源、加快速度、不影响效果的做法。

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The risk assessment of prenatal genetic screening procedure simplified for thalassemias

XIAO Qizhi，LI Lianxiang，XIE Jianhong，LI Lei，WANG Ge，ZHANG Jingwei，LONG Ruoting，ZHOU Yuqiu★
（Zhuhai Institute of Medical Genetics＆amp;Department of Clinical Laboratory，Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthc are Hospital，Zhuhai，Guangdong，China，519001）

Objectives To evaluate the feasibility of prenatal genetic screening for thalassemias by full blood cell analysis（full blood count，FBC）combined with thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the two-step method）instead of the FBC combined with hemoglobin（Hb）analysis and thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the three-step method）.Methods The results of FBC and Hb analysis as well as molecular diagnosis of thalassemias of 6 291 pregnant women and their spouses from January 1，2014 to December 31，2015，atantenatal clinics of ZhuhaiCity were analyzed retrospectively byχ2test.The reliability and economic viability of the two-step method were compared with the three-step method of prenatal genetic screening for thalassemias.Results Taking the classic three-step method as a standard，the sensitivity，specificity，negative predictive value and positive predictive value，and accuracy of the two-step method were 98.25％，99.52％，85.98％，88.12％，91.23％，respectively.The rate of missed diagnosis of the two-step method to HbH disease，β-thalassemia trait，Hb variants and δβ thalassemia/hereditary persistence of fetal hemoglobin（HPFH）were 2.59％（2/77），0.01％（2/1 695），8.78％（13/148），and 48.30％（43/89）respectively.Conclusions Prenatal genetic screening process of thalassemia with three-step method has its adavantages.It can avoidfailure of detection of not just HbH disease and Hb variants but alsoδβ-thalassemias/HPFH，and what's more point to clear direction for DNA diagnosis of thalassemias.The three-step method tentatively can't be replaced by the two-step method.

Thalassemia；Genetic screening；Phenotype-genotype；Hemoglobin（Hb）variants

广东省科技计划项目（2009A030301002）；珠海市卫生和计划生育局医学科研项目（2014062）

珠海市妇幼保健院检验科＆amp;珠海市医学遗传研究所，广东，珠海519001

★通迅作者：周玉球，E-mail：zhzhouyq@126.com