抗阻和被动拉伸联合训练对大鼠腓肠肌卫星细胞激活相关因子基因表达的影响*

吴国梁，李 娜

(广西科技师范学院 体育学院,广西 来宾 546199)



抗阻和被动拉伸联合训练对大鼠腓肠肌卫星细胞激活相关因子基因表达的影响*

吴国梁，李 娜

(广西科技师范学院 体育学院,广西 来宾 546199)

目的：通过大鼠运动实验模型，观察抗阻和被动拉伸训练后大鼠腓肠肌HGF、MGF及其基因表达的变化，研究被动拉伸和抗阻联合训练对骨骼肌卫星细胞激活和增殖的影响；方法：32只成年健康SD大鼠随机分为4组，对照组(N组，n=8)、被动拉伸组(S组，n=8)、抗阻组(R组，n=8)和混合组(C组，n=8)。N组不做任何处理，对S组和C组大鼠右侧腓肠肌手动进行被动拉伸训练，每分钟15次，每次维持2s，每天15min，每周4次，共10周。对R组和C组进行尾部负重爬梯训练，负重为体重的200%，每周3天，每天2组，每组3次，共10周。训练结束后取右侧腓肠肌，测定腓肠肌湿重，ELISA法测定MGF，HGF，RT-PCR测定MGF、HGF的基因表达。结果：训练组实验后各项指标均有显著上升，其中联合训练组各项指标上升最为明显，与N组比较差异非常显著(P<0.01)，与R组相比较除HGF外其余指标也差异显著，但HGF mRNA较S组却无明显差异；S组各项指标虽也有显著上升，但较R组上升幅度要低，且差异非常显著；结论：被动拉伸训练和抗阻训练都可以有效上调，HGF、MGF及其mRNA的表达，进而激活肌卫星细胞进入细胞周期分裂增殖，且两种训练对卫星细胞激活的效果可以叠加。

被动拉伸，抗阻训练，联合训练，HGF，MGF

肌卫星细胞(Satellite cell，SC)是存在于肌膜和基底膜之间的一种未分化的成肌细胞，与受损肌纤维的修复和再生密切相关[1]。通常肌卫星细胞处于静息状态，在受到外界刺激时，如损伤、牵拉或者肌肉萎缩病变等，卫星细胞能够被激活进入细胞分裂周期，从而实现对肌纤维的修复、肥大或再生，而卫星细胞激活的数量与肌肉肥大或对损伤修复的速度密切相关[2]。研究证实，肝细胞生长因子(HGF)、机械生长因子(MGF)等关键调节因子在卫星细胞的激活和增殖过程中起着重要的调节作用[3]。一般认为抗阻训练可以有效激活骨骼肌中卫星细胞，在维持骨骼肌卫星细胞池的数量和促进骨骼肌肥大中具有显著意义。近来也有研究发现被动拉伸也可以有效提高卫星细胞数量，促进骨骼肌的增长和肥大[4]。本研究对 SD 大鼠进行负重爬梯和被动拉伸两种方式的训练，对腓肠肌HGF、MGF的含量及其基因表达进行对比，探讨促进卫星细胞激活和增殖的有效途径，为制订运动员休训期肌肉状态的保持、长年卧床疾病患者和老年性肌萎缩的康复训练方案提供依据。

1 材料和方案

1.1 实验动物和分组

清洁级8周龄健康成年SD大鼠32只,体重180g～200g。实验动物由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。分笼饲养，每个鼠笼2只，常规饲料喂养，自由饮水。环境温度保持在22℃ ± 2℃ ，湿度40%～ 60%，自然光照。适应性饲养2周后随机分为对照组(N组，n=8)、被动拉伸组(S组，n=8)、抗阻组(R组，n=8)和联合组(C组，n=8)。对S组的右后腿腓肠肌进行手动伸展训练，对R组进行负重抗阻训练，对C组进行负重抗阻训练后再对其右后腿进行手动伸展训练。

1.2 抗阻和拉伸训练方案

抗阻训练采用尾部负重爬梯法进行。爬梯高1m，梯阶2cm，倾斜角85°。采用食物诱惑法适应性训练2周，熟练后开始正式训练。初始负荷为大鼠体重的30%，以后每周递增25%，直至体重的200%，一直维持到训练结束。抗阻训练每周训练3天，在每周的一、三、五进行，每天2组，每组3次，共10周。次间休息1min，组间休息2min。

将S组和C组大鼠按40 mg/kg体重用戊巴比妥钠腹腔麻痹后，对其右后腿都进行踝关节的被动背屈，适中力度拉伸腓肠肌，每分钟15次，每次维持2s，每天15min，每周4次，在每周的二、四、六、日进行，共10周。其中C组大鼠的拉伸练习在抗阻训练后进行。

1.3 选取标本

最后一次训练完成后24h将大鼠断头处死，分离右后腿腓肠肌，生理盐水清洗称重后用锡纸包裹放入液氮内保存待测。

1.4 指标的测定

1.4.1 腓肠肌组织MGF、HGF 含量的测定

取腓肠肌约 0.2 g用眼科剪剪碎后按1∶9 的比例加入冰生理盐水，置入玻璃匀浆器中研磨6min～8min抽取匀浆。取部分匀浆液以 3000 r/min 转速离心 10 min，提取上清液，即为 10%的组织匀浆液。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定MGF，HGF的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。试剂盒由上海乔羽生物科技有限公司提供。

1.4.2 RT-PCR测定MGF、HGF、IGF-ⅠEa基因表达水平

Trizol法提取RNA样本，按照说明书进行操作。逆转录反应体系共20μL，包含 DEPC水6μL，RNA酶抑制剂(50U/uL)0.5μL，随机引物(50pM/uL)2μL，RNA 2μL，RNA酶抑制剂(50U/uL)0.5μL，5×bueffr 4μL，dNTP MIX 2μL，DTT 2μL，M-MLV(200Uu/L) 1μL。从Genbank查找大鼠MGF mRNA和HGF mRNA全基因序列及引物并由北京安必奇生物科技有限公司合成(见表1)，以GADPH为“管家基因”进行PCR扩增。取15μL PCR扩增产物用goldenview染色，在100伏电压下用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳40min，然后在凝胶成像系统上观察结果，用Imgaer TM 2200分析软件检测基因表达量OD值，并以GADPH的检测值为基准计算标本的相对基因表达量。

表1 实验中各引物序列

注：以上引物序列查自美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库GenBank。

1.5 统计分析

本研究所有结果均用SPSS18.0进行处理，数值用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，显著性水平取P<0.05，非常显著取P<0.01。

2 研究结果

2.1 腓肠肌湿重与体重

表2 实验后各组大鼠腓肠肌湿重和体重比

注：与N组比较，*p<0.05，** p<0.01；与S组比较，#p<0.05，## p<0.01。

由表2，腓肠肌湿重各实验组较对照组有所升高，其中C组最高，R组次之，S、R、C组与N组相比较均差异非常显著，R、C组与S组比较差异也非常显著，但R组与C组间差异不显著；腓肠肌与体重比S组与N组无显著差异，R、C组较S、N组稍高，其中与N组差异非常显著，与S组差异显著，但R组与C组间差异不显著。

2.2 实验后各组腓肠肌 MGF、HGF水平比较

表3 各组腓肠肌HGF、MGF水平比较(pg/mg prot)

注：与N组比较，*p<0.05，** p<0.01；与S组比较，#p<0.05，## p<0.01；与R组比较，☆p<0.05，☆☆p<0.01。

对各组样本MGF、HGF水平进行测定后，可得表3。可见，MGF水平训练组显著高于对照组，与N组相比较，S组存在显著差异，R组和C组存在非常显著差异，与S组相比较，R组和C组存在非常显著差异，但R组和C组间无显著差异；HGF水平训练组显著高于对照组，与N组相比较，S组和C组存在显著性差异，R组存在非常显著性差异，与S组相比较，R组差异非常显著，C组差异显著，R组与C组差异显著。

2.3 各组腓肠肌MGF、HGF、IGF-ⅠEa mRNA表达水平比较

表4 各组腓肠肌HGF mRNA、MGF mRNA表达水平比较

注：与N组比较，*p<0.05，** p<0.01；与S组比较，#p<0.05，## p<0.01；与R组比较，☆p<0.05。

对各组样本MGF、HGF mRNA进行测定后，可得表4。由表4，MGF mRNA表达水平S组、R组、C组高于N组，且差异非常显著，其中R组平均水平最高，R组和C组与S组相比较也存在非常显著性差异，但R组和C组间无显著差异；HGF mRNA表达水平S组、R组、C组高于N组，且差异非常显著，其中C组平均水平最高，R组高于S组，组间相比较差异非常显著，C组和R、S组间差异显著，但M组和S组比较差异不明显。

3 讨论

肝细胞生长因子(HGF)是一种由多种细胞分泌的、能刺激多种类型细胞分化增殖再生、运动和迁移的多功能细胞因子，是激活肌卫星细胞的关键调节子，肌肉发育和再生的早期都可以检测到HGF的表达[5]。卫星细胞或骨骼肌受到机械牵拉时，HGF将快速从其储存部位快速释放，并与卫星细胞表面的HGF 受体(c-met) 相结合，进而激活卫星细胞[6]。机械生长因子(MGF)是一种对机械牵拉敏感的局部自分泌性生长因子，受机械刺激和组织损伤时表达，可以激活卫星细胞，增加成肌细胞的增殖能力[7]。可见， HGF和MGF及其mRNA的表达水平在一定程度上也反映了骨骼肌卫星细胞的激活和增殖程度。

过去较多研究认为运动训练可以提高局部肌组织HGF、MGF及其基因表达，促进肌卫星细胞的增殖和分化，但对于运动强度和形式与肌卫星细胞激活之间的关系尚未完全明确。如张山佳等(2010)发现大鼠负重游泳训练可以明显上调骨骼肌MGF mRNA表达，促进骨骼肌的肥大，但所采用的负荷相对较小[8]。叶雷雷(2012)在实验中观察到中等强度下坡跑渐增负荷力竭运动后48h大鼠肌组织HGF含量持续上升，变化非常显著，认为离心运动可明显提升HGF在肌组织的表达，对肌组织的修复和肥大有较明显的促进作用[9]。潘同斌等(2012)则观察到大负荷力竭运动后大鼠腓肠肌MGF表达显著上升，且在24h可达峰值，认为大负荷训练使MGF表达上调，并与骨骼肌损伤的修复密切相关[10]。王静等(2011)在实验中观察到10周大强度负重爬梯力量训练可显著上调骨骼肌MGF mRNA表达，引起骨骼肌的肥大[11]。这些研究结果都显示运动训练对肌卫星细胞的有效激活，但在运动强度和运动方式上并没有进行横向对比。为了进一步明确运动强度与卫星细胞激活的关系，陈涛等(2011)通过实验对力量训练和耐力训练进行对比后，认为两种训练都可使小鼠胫前肌HGF mRNA表达明显上调，其中力量训练的表现更加明显，但两种训练方式综合使用后效果并不叠加[1]。而陈彩珍等(2014)对大鼠进行抗阻力量训练和耐力训练，对比后发现抗阻力量训练组大鼠腓肠肌湿重和肌纤维横截面积增加明显，而耐力组变化不明显，两种训练方式MGF mRNA表达均有上升，其中力量训练组上升更加显著[12]。可见抗阻力量训练相较中等强度耐力训练对HGF、MGF mRNA表达的提升和肌卫星细胞的激活更显著。由表2，本研究中R组和C组腓肠肌湿重最大，与S组也存在显著性差异，但在体重中所占的比例的增加并不明显。这可能是经过抗阻训练，不但腓肠肌的重量有所增加，而且大鼠的体重也有相应的增加所导致。另由表3、表4，本研究中R组抗阻力量训练的结果与相关研究相似，抗阻训练明显上调大鼠腓肠肌HGF、MGF及mRNA表达(P<0.01)，并进而促进肌肉肥大和肌重量的显著提升。

另一方面，有些研究中观察到对于骨骼肌的机械刺激，离心的方式较向心的方式更有利于激活肌卫星细胞。如Imaoka Y等(2015)对研究对象的左右腿股外侧肌分别进行向心收缩训练和离心收缩训练，结果发现与向心收缩训练相比较，离心收缩训练后的Ⅱa型肌纤维显著增加，HGF mRNA显著上调[13]。此外，Y. Kamikawa等(2013)在对小鼠腓肠肌被动拉伸的实验中观察到，重复性拉伸和持续性拉伸都可以促进腓肠肌的肥大，其中重复性拉伸更加显著。这提示我们机械刺激对肌卫星细胞的激活可能主要作用于肌肉的拉长过程，但他们并未对被动拉伸和主动收缩进行对比。为了验证被动拉伸对肌卫星细胞的激活，本研究对鼠腓肠肌分别进行被动拉伸和抗阻收缩训练。结果如表3、表4，单纯的被动拉伸训练后大鼠腓肠肌重量明显上升，肌组织HGF、MGF及其 mRNA表达同样显著上升，但上升的幅度较抗阻性力量训练稍低，而被动拉伸和抗阻混合训练组肌组织HGF、MGF及其 mRNA表达的上升最为明显，其幅度甚至超过单纯的抗阻训练。可见，被动拉伸练习可以通过上调HGF、MGF mRNA的表达增加HGF、MGF的复制并进而激活肌卫星细胞，且与抗阻性力量训练可以效果叠加。但有意思的是C组HGF mRNA表达的上调较S组却无显著差异，其原因尚需进一步研究。另外，也有人发现绝经期妇女拉伸练习后MGF并无明显改变[14]，但这也可能研究对象及拉伸的方式和剂量有关。可以推断，被动拉伸训练也可以促进肌卫星细胞的激活和增殖，且与抗阻训练配合使用效果更佳。但在被动拉伸时所采取的强度、幅度及频率对于不同的对象可能存在较大的个体差异，其之间的关系尚需做进一步的研究。

4 结论

被动拉伸训练和抗阻训练都可以有效上调，HGF、MGF及其mRNA的表达，进而激活肌卫星细胞进入细胞周期分裂增殖。被动拉伸训练和抗阻训练对卫星细胞激活的效果可以叠加。这也提示我们，对于无法进行自主抗阻训练的患者可以采用被动拉伸的方法帮助其肌肉状态的保持和恢复。

[1] 陈涛,陈彩珍,卢健.耐力、力量和混合运动对成年C57BL/6小鼠骨骼肌卫星细胞激活信号通路的影响[J].体育科学,2011,31(9):69-76

[2] 门杰,李越.骨骼肌卫星细胞的研究进展[J].吉林体育学院学报,2013,29(5):71-74

[3] 邱烈峰.运动对肌卫星细胞的影响及其机制研究进展[J].信阳师范学院学报(自然科学版), 2015,28(3):463-468

[4] Y. Kamikawa, S. Ikeda, K. Harada, A. Ohwatashi, and A.Yoshida. "Passive repetitive stretching for a short duration within a week increases myogenic regulatory factors and myosin heavy chain mRNA in rats' skeletal muscles," The Scientiic World Journal, 2013(6) ：2013

[5] 刘芳,费菁,陈敏，等.肌肉发育中肝细胞生长因子(HGF)生物学作用研究进展[J].中国畜牧兽医，2010，37(12)：63-67

[6] 邓启烈,莫伟彬.骨骼肌卫星细胞在组织工程与运动损伤修复中的应用[J].中国老年学杂志, 2014,34(10): 2899-2901

[7] 黄丽敏,贾华,赵斌. 衰老性肌肉丢失与机械生长因子相关研究的进展[J].武汉体育学院学报, 2010,44(4): 70-74

[8] 张山佳,丁树哲.运动对大鼠骨骼肌IGF-Ⅰ、MGF基因表达的影响[J].西安体育学院学报, 2010,27(1): 80-83

[9] 叶雷雷.力竭运动及钝挫伤对大鼠骨骼肌卫星细胞及肝细胞生长因子的影响[D].扬州：扬州大学, 2012：50

[10] 潘同斌,王晓雪,唐芳,等.大负荷运动及其恢复期间大鼠骨骼肌超微结构及MGF的变化[J]. 中国运动医学杂志, 2012, 31(10): 868-871

[11] 王静,苏有存,卢健.负重爬梯训练对大鼠腓肠肌IGF-Ⅰ、IGF-IEa、MGF和MSTN基因表达的影响[J].山东体育学院学报,2011,27(5): 55-58

[12] 陈彩珍,卢健.抗阻训练与耐力训练对小鼠腓肠肌卫星细胞激活作用的影响[J].成都体育学院学报,2014,40(4):55-59, 72

[13] Imaoka Y, Kawai M, Mori F, Miyata H. Effect of eccentric contraction on satellite cell activation in human vastus lateralis muscle J. Physiol Sci. 2015，65(5):461-9

[14] Dieli-Conwright CM1, Kiwata JL, Tuzon CT, Spektor TM, Sattler FR, Rice JC, Schroeder ET. Acute Response of PGC-1α and IGF-1 Isoforms to Maximal Eccentric Exercise in Skeletal Muscle of Postmenopausal Women. Applied physiology, nutrition, and metabolish.2016 ,30(4):1161-70

Effects of Combination of passive Stretching and Resistance Exercise on HGF and MGF mRNA of Rat's Gastrocnemius

WU Guo-liang,LI Na

(Department of PE, Guangxi Science & Technology Normal University,Laibin 546199, China)

Objective: To investigate the effect of the combination of passive stretching and resistance exercise on the activation of skeletal muscle satellite cell, through examine the expression of HGF、MGF mRNA of rat's gastrocnemius. Methods: 32 adult SD rats were randomly divided into 4 groups: control group(group C,n=8),nothing were done; stretch group (group S,n=8), animals right gastrocnemius muscle was stretched repetitively for 2 seconds/time,15 times/min, 15min daily and 4 times/week under anesthesia; resistance group (group R, n=8), animals underwent 10 weeks(3 times/set, 2sets/day, 3days/week) climbing ladder training with weights (as 200% of their body weights) attached to the rats tails ；combination group(group C, n=8), animals underwent both stretching and resistance trains for 10 weeks. After training, animal's the right gastrocnemius were token respectively. The protein HGF、MGF were detected by the ELISA, RT-PCR was applied to detect the expression of HGF mRNA and MGF mRNA in gastrocnemius muscle. Results: After the combination of passive stretching and resistance exercise ,the weight of gastrocnemius muscle, the expression of HGF,MGF and mRNA was higher in group S,R,C than the group N(P<0.05).Compare to the group N, the expression of HGF,MGF and their mRNA was most in the group C (P<0.01).Compare to group R, the expression of HGF mRNA, MGF mRNA and MGF was high significant differences(P<0.05).But compare to the group S, the expression of HGF mRNA of the group C was not significant differences; Compare to the group R, the expression of HGF,MGF and their mRNA was high significant differences in group S. Conclusion: Both passive stretching and resistance exercise can effectively improve the expression level of the HGF,MGF and their mRNA, and activate the satellite ecll into the cell cycle to differentiation and proliferation. And the effect of them can be accumulated.

passive stretching；resistance exercise；comination; satellite cell; activation

2016-09-26

吴国梁(1976-)，男，山东郓城人，讲师，硕士 通讯作者：李娜(1979)，女，山东郓城人，讲师，硕士

广西高校中青年教师基础能力提升项目(KY2016YB551)

G804

A

1007-323X(2016)06-0104-04

研究方向：运动损伤的预防与康复