α-硫辛酸对溃疡性结肠炎小鼠Th17相关炎症因子表达影响研究*

中国医科大学附属第一医院消化内科(沈阳 110001) 孙 菁 孙明军



α-硫辛酸对溃疡性结肠炎小鼠Th17相关炎症因子表达影响研究*

中国医科大学附属第一医院消化内科(沈阳 110001) 孙 菁 孙明军△

目的：探讨α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)对溃疡性结肠炎小鼠Th17相关炎症因子表达的影响。方法：将雄性Balb/c小鼠(22～25 g)随机分为对照组(Control)、ALA对照组(ALA)、溃疡性结肠炎组(UC)、ALA治疗组(UC+ALA)四组，每组10只，观察各组小鼠疾病活动指数(DAI)评分，比较结肠质量指数及结直肠组织病理变化；酶联免疫吸附(ELISA)检测小鼠血清中IL-17、IL-21分泌情况，RT-PCR检测结肠组织TNF-α、TGF-β mRNA表达情况。结果：结肠质量指数、DAI及组织病理学评分在对照组及ALA组中无明显差异，但在UC组中显著升高，在UC+ALA组中明显降低(P<0.05)；IL-17、IL-21在对照组及ALA组小鼠血清中的水平无明显差异，但在UC组中显著升高，在UC+ALA组中明显降低(P<0.05)；TNF-α、TGF-β mRNA在对照组及ALA组小鼠结肠组织中的表达水平无明显差异，但在UC组中显著升高，在UC+ALA组中明显降低(P<0.05)。结论：α-硫辛酸能够降低TNBS引起的溃疡性结肠炎小鼠IL-17、IL-21、TNF-α、TGF-β等Th17相关炎症因子的表达水平，改善炎症反应及病理损伤。

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)病因及发病机制尚未完全阐明，如何有效缓解UC值得深入研究[1]。近期研究发现炎症反应以及免疫因素在UC发生发展过程中存在重要影响[2]。辅助性T细胞(T Helper cell，Th)17是有别于Th1及Th2的Th细胞亚群，分泌白细胞介素-17(IL-17A)等细胞因子参与UC发病[3]。α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)是一种强效抗氧化剂，具有较好的抗氧化应激及降低炎症反应作用。笔者前期研究发现ALA在TNBS诱导的UC模型中具有保护作用，但其发挥治疗作用机制尚未明确。本文在前期研究基础上，探讨ALA干预溃疡性结肠炎小鼠过程中对Th17相关细胞因子以及炎症反应的影响，进一步确定ALA在UC治疗中的分子机制。

材料及方法

1 材 料 雄性BALB/c小鼠，22～25 g，由中国医科大学动物中心提供；三硝基苯磺酸(TNBS)、α-硫辛酸(ALA)购自Sigma(美国)；小鼠白介素-17 ELISA试剂盒、小鼠白介素-21 ELISA 试剂盒均购自博士德(武汉)；总RNA提取试剂盒购自天根生化(北京)；M-MLV逆转录酶购自百泰克(北京)；RIPA裂解液、-30 ℃低温切片机购自Leica(德国)，体式显微镜购自Motic(厦门)，凝胶电泳及成像系统购自北京六一。

2 动物分组及处理 将雄性Balb/c小鼠(22～25 g)共分为四组：对照组(Control)，ALA对照组(ALA)，溃疡性结肠炎模型组(UC)，ALA治疗组(UC+ALA)，每组10只。采用结肠灌注三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导建立UC模型，对小鼠禁食24 h后进行乙醚麻醉，3 mg TNBS溶解于0.12ml乙醇，并通过长约4 cm导管缓慢经小鼠肛门灌注入小鼠结肠，灌注完成后将小鼠倒立维持2～3 min；Control及ALA组灌注50%乙醇进行假手术处理；灌注后，ALA及UC+ALA组给予80 mg/kg bw/day ALA处理，持续7 d；Control及UC组给予等体积2 %DMSO处理，持续7 d；观察小鼠生理状况，参考Cooper等的方法，观察测量大鼠、精神状态、腹泻情况、以及体重变化，综合评价疾病活动指数(Disease activity index，DAI)；实验结束后处死小鼠并称重，切除结肠组织并称重，计算结肠质量指数(结肠质量/体重)。收集结肠组织冻存或固定用于后续实验。

3 病理切片HE染色观察 对各组小鼠同一结肠区域组织进行甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，对根据HDS炎症分级标准对各组切片进行组织损伤学评分[4]。对病理切片进行观察，200倍光镜下，随机选取8个视野进行观察和评分。评分标准如下：视野中正常肠粘膜记为0分；缺少1/3隐窝记为1分，缺少2/3隐窝记为2分；上皮层保持完整，存在少量炎症细胞浸润，记为3分；黏膜层、黏膜下层以及肌层炎症细胞增多且明显存在炎症细胞浸润，隐窝及上皮层均消失，记为4分。对8个视野进行评分后取平均值作为该组样本总的组织病理学评分。

4 ELISA检测血清样本中IL-17、IL-21水平 取各组小鼠血清适当稀释，并对L-17及IL-21标准品进行倍比稀释，参照ELISA试剂盒说明进行操作，酶标仪450nm波长检测各组吸光值OD450，制作标准曲线，计算血清样本中细胞因子IL-17、IL-21浓度，每样本检测6次，取均值计算。

5 RT(逆转录)-PCR检测TNF-α、TGF-β mRNA表达情况 收集各组小鼠结肠黏膜组织样本，利用总RNA提取试剂抽提各组小鼠结肠黏膜组织RNA，经M-MLV逆转录酶反应合成cDNA第一链，加入相应检测引物进行PCR检测TNF-α、TGF-β 基因mRNA表达水平，根据NCBI提供基因序列信息设计，TNF-α上游引物序列： 5’- GAGTCCGGGCAGGTCTACTT -3’；TNF-α下游引物序列： 5’- CCAGGTCACTGTCCCAGCATC -3’；TGF-β上游引物序列： 5’-GCCAGATCCTGTCCAAACTA-3’；TGF-β下游引物序列： 5’-GTTGTTGCGGTCCACCATTA-3’；以β-actin为内参基因，其上游引物序列为： 5’-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’； β-actin下游引物序列为：5’- GATGTCACGCACGATTTCC -3’；设置PCR反应条件为：95℃，预变性3 min；95℃，变性30 s；58 ℃，退火30 s；72℃，延伸30 s；循环数30。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扫描分析光密度值，计算TNF-α、TGF-β对β-actin的相对表达量。

6 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件，数据以平均数±标准差(Mean±sd)表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析；P<0.05为存在统计学差异。

结 果

1 小鼠结肠炎活动程度评估 Control组及ALA对照组小鼠饮食正常、精神状态良好，大便性状未改变，体重略有增加，结肠质量指数无明显变化；UC组小鼠造模给药后，逐渐出现懒动、厌食、腹泻便血，体重减轻，结肠质量指数增加，DAI评分显著上升(P<0.05)；而在UC+ALA治疗组，进行ALA干预后，相比UC组，小鼠厌食情况有所减轻，体重下降程度减缓，便血逐渐减少或隐血，结肠质量指数下降，DAI评分有所下降(P<0.05)。提示ALA对TNBS诱导的溃疡性结肠炎具有一定保护作用。

表1 各组小鼠结肠质量指数及DAI评分

2 小鼠肠粘膜组织学病理情况变化 HE染色结果显示，Control及ALA组小鼠结肠组织黏膜表面光滑，未见明显充血及炎性水肿，肌层完整；UC组小鼠经TNBS诱导后，小鼠结肠黏膜组织高度充血水肿，上皮细胞损伤脱落，出现间断性溃疡面，结肠厚度增加，黏膜中存在大量炎性细胞浸润，肌层完整性受到破坏，病理评分显著升高；UC+ALA组小鼠肠粘膜充血水肿症状相对UC模型组明显减轻，溃疡程度减低，炎症细胞浸润程度减轻，有轻微渗出，病理评分相比UC组降低(P<0.05)(图1)。

图1 结肠组织病理学观察(HE，200×)

表2 结肠组织病理学评分

3 血清IL-17、IL-21水平变化 ELISA检测结果显示，IL-17及IL-21在Control及ALA组小鼠血清中含量无明显差异，但在UC组中水平明显上调(P<0.05)，而经ALA干预，UC+ALA组，与UC模型组比较，IL-17与LI-21水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

4 结肠黏膜TNF-α、TGF-β mRNA表达情况 Control组与ALA组小鼠结肠组织TNF-α、TGF-β mRNA表达水平无显著差异；与Control组比较，UC模型组小鼠结肠组织中TNF-α、TGF-β表达有所增加，存在显著差异，而ALA干预后，UC+ALA组小鼠结肠组织中TNF-α、TGF-β表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

表3 各组小鼠血清IL-17、IL-21含量比较(pg/ml)

图2 结肠粘膜组织中TNF-α、TGF-β mRNA表达(A：RT-PCR检测结肠粘膜TNF-α、TGF-β mRNA表达；B：结肠粘膜TNF-α、TGF-β mRNA相对表达量；与Control组比较，a P<0.05；与UC组比较，b P<0.05)

讨 论

溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病(IBD)的一种，以结直肠黏膜及黏膜下炎症病变及溃疡为主要表征，有恶变的危险。全球范围内，流行病学研究显示UC的患病率成逐渐上升趋势。目前临床治疗UC主要采用氨基水杨酸类、免疫抑制剂抗生素类、以及激素类等传统药物，但均具有一定程度副作用，开发新的药物及治疗靶点仍然是UC治疗的研究焦点。α-硫辛酸(ALA)是一种公认的全能天然抗氧化剂，不仅能够直接清除自由基，同时还可以促进其他抗氧化剂再生，对于急慢性炎症均有良好的抗炎功效。目前α-硫辛酸(ALA)对UC的保护作用研究还处于起步阶段，相关分子机制仍需要深入探讨[5]。笔者前期通过研究发现,ALA能够抑制TNBS诱导的UC小鼠模型中氧化应激反应以及MAPK信号通路活化，抑制细胞凋亡，减少组织损伤，另有报道指出MAPK及STAT3信号通路的激活能够促进Th17细胞分化[6]。因此，本实验在前期研究基础上进一步探讨在ALA对UC模型作用过程中Th17相关细胞因子表达及分泌的影响。

本研究结果显示，Control组及ALA对照组小鼠生理状态良好，而UC组小鼠造模给药后，逐渐出现精神萎靡、厌食、体重逐渐减轻，腹泻便血，结肠质量指数增加，DAI评分显著上升，结肠组织病理评分显著升高；而在UC+ALA治疗组，进行ALA干预后，相比UC组，小鼠精神状态好转，厌食减轻，体重下降减少，便血轻微或隐血，结肠质量指数下降，DAI评分有所下降，结肠组织病理评分有所降低，提示ALA能够抑制TNBS诱导的溃疡性结肠炎病情进展。

Th17细胞是近年来发现的一种Th1、Th2之外新的Th细胞亚群，以特征性分泌IL-17而得名，参与炎症反应的发生。有研究认为，UC的发生与调节性T细胞(Treg)、Th17细胞之间的平衡破坏存在密切关联[7]。上调DSS诱导的小鼠肠炎模型中IL-10水平，能够促进Treg细胞分化而降低Th17细胞比例，重建Treg/Th17平衡，降低IL-17、IL-6、IL-23等炎症因子水平，从而改善溃疡性结肠炎症反应[7]。IL-17是Th17细胞特异性分泌的细胞因子，具有多种生物学活性，是体内强效的炎症因子之一，能够诱导促炎症因子IL-6、TNF-α等表达，参与组织炎症进展，与多种自身免疫性疾病如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病以及炎症性肠病等密切相关。除了IL-17以外，Th17细胞还分泌其他一些炎症因子包括TNF-α、IL-21、IL-22等，进而活化中性粒细胞使之募集至炎症部位，介导前炎症反应[8]。Th17分化主要受到IL-6、IL-21、TGF-β等的调节作用。TGF-β是Th17细胞分化的重要因子之一，IL-21由Th17细胞大量自分泌后，与TGF-β协调作用，进一步作用于Th17细胞，促进细胞向Th17亚群分化[9]。大量研究表明，UC患者血清中IL-17水平显著上升[10]。TNF-α作为一种重要的促炎症因子，能够促进其他炎症因子释放，进而放大炎症反应，上调内皮细胞粘附因子表达水平，增加肠道通透性以及离子转运加重腹泻，参与UC炎症反应过程以及免疫应答，在UC发病过程以及病程进展过程中扮演重要角色[11]。研究表明，TNF-α在UC发病期间表达水平显著上升，与UC发生及发展具有重要关联[12]。

本实验ELISA检测结果显示，IL-17及IL-21在Control及ALA组小鼠血清中含量无明显差异，但在UC组中水平明显上调，而经ALA干预后，IL-17与LI-21水平显著降低，差异有统计学意义；RT-PCR检测结果显示，TNF-α、TGF-β mRNA表达水平在Control组与ALA组小鼠结肠组织中无显著差异，而在UC模型组小鼠结肠组织中表达显著增加，经ALA干预后，UC+ALA组小鼠结肠组织中TNF-α、TGF-β表达明显降低，差异有统计学意义。说明ALA可能通过抑制TGF-β及IL-21表达抑制Th17细胞分化，并通过反馈调节进一步抑制IL-17、 TNF-α以及IL-21等炎症因子的表达分泌，抑制炎症细胞的浸润，促进组织损伤修复，起到治疗UC的作用。

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(收稿：2016-04-27)

Effect of alpha acid-lipoic on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital，China Medical University

(Shenyang 110001) Sun Jing Sun Mingjun

Objective: To investigate the effect of α-lipoic acid (ALA) on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis. Methods: The Balb/c mouse model with ulcerative colitis was induced by three sulfonic acid trinitrobenzene (TNBS). Male Balb/c mice (22～25 g) were divided into four groups, with control group (Control), ALA control group (ALA), ulcerative colitis group (UC), and ALA in the treatment of ulcerative colitis group (UC+ALA),10 mice in each group. The colonic mass index, the disease activity index (DAI) and the pathological score of HE (HDS) in each group were calculated. The secretion of IL-17 and IL-21 in mice serum was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The autophagy gene TNF-α, TGF-β mRNA level was detected by RT-PCR. Results: There was no significant difference between Control group and ALA group in the quality index, DAI and histopathology score, but it was significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference between IL-17 and IL-21 in Control group and ALA group of mice serum levels, but increased significantly in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference in the expression levels of TNF-α, TGF-β mRNA and in Control group and ALA group, but significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). Conclusion: The α-lipoic acid can reduce the expression levels of IL-17, IL-21, TNF-α, TGF-β and other Th17 related inflammatory factors in ulcerative colitis mice induced by TNBS, and improve the inflammation, as well as promote pathological damage repair.

Colitis,ulcerative/immunology Thioctic acid @Th17 cells Inflammation mediators Mice

*辽宁省科技厅科技攻关项目(2013020198-202)

结肠炎,溃疡性/免疫学 硫辛酸 @辅助性T细胞17 炎症介导素类 小鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.003

△通讯作者