骨髓形态联合免疫分型检测对慢性淋巴细胞白血病诊断及预后价值研究*

陕西省人民医院血液病研究室(西安 710068)

韩秀蕊 杨娣娣 张丽洁 李艳春 赵 园 王九菊 赵乔佳杰 魏绪仓△



·临床检验·

骨髓形态联合免疫分型检测对慢性淋巴细胞白血病诊断及预后价值研究*

陕西省人民医院血液病研究室(西安 710068)

韩秀蕊 杨娣娣 张丽洁 李艳春 赵 园 王九菊 赵乔佳杰 魏绪仓△

目的：探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者骨髓形态、免疫表型特征，以及它们之间的关系。方法；采用流式细胞术对89例CLL患者骨髓或外周血标本进行免疫表型检测，依据细胞形态学分析将CLL患者分为典型CLL和混合型CLL两组，比较两组之间各抗原表达差异，并分析其对预后的影响。结果： 89例CLL患者抗原表达阳性率由高至低依次为CD19(98.9%)、HLA-DR(97.8%)、CD5(88.8%)、CD20(85.4%)、CD22(71.9%)、CD23(61.8%)、CD38(39.3%)、FMC-7 (11.2%)、CD3(2.2%)。细胞形态学分型89例CLL中，典型CLL72例(80.9%)，混合型CLL17例(19.1%)。CD38在典型CLL及混合型CLL组间的阳性表达存在显著的统计学差异,CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、HLA-DR、FMC-7各抗原在两组间表达差异无统计学意义.预后分析显示混合型CLL生存期较典型CLL短(P<0.01),死亡患者与存活患者之间CD38表达差异有明显的统计学意义。结论：细胞形态学结合免疫表型分析不仅是CLL诊断、鉴别诊断的主要手段，而且对预后判断具有重要价值。

慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia ,CLL)是淋巴细胞的恶性增殖性疾病，其特征为近似成熟的小淋巴细胞在外周血、骨髓、外周淋巴器官高度聚集。2008年国际CLL诊断组与美国国家癌症研究所共同发表了CLL诊断指南[1]，定义CLL为B细胞肿瘤。本研究对89例初诊CLL患者的细胞形态学、免疫表型资料进行了回顾性分析，现报告如下。

对象和方法

1 研究对象 89例患者选自2005年l月至2015年10月在我院就诊的CLL患者，其中男60例 , 女29 例, 年龄27～86岁。

2 细胞形态学检查 所有患者骨髓涂片经瑞-姬氏染色后由有经验的专业人员进行细胞形态学分析，每份骨髓涂片分类200～500个有核细胞，CLL诊断及分型标准参照 《血液病诊断及疗效标准 》[ 2]。

3 免疫分型检测 取肝素抗凝的骨髓液或外周血 3 ～ 5 ml , 经淋巴细胞分离液分离获取单个核细胞 , 以CD45/ SSC设门采用FACSCalibur 流式细胞仪(美国 Becton Dickinson 公司) 进行检测，测定结果采用 CellQuest 软件进行分析。检测的单克隆抗体包括、 CD5、CD19、 CD20、CD22、CD10、CD23、CD38、HLA-DR、FCM-7、CD3、CD7。阳性标准: 白血病细胞表面抗原阳性率 ≥20 %为阳性。

4 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件，计数资料比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法及Long-rank检验。

结 果

1 细胞形态学特征 89例CLL患者中，典型CLL最常见占 72例(80.9%)，CLL/PL15例(16.9%)，大小细胞混合型CLL最少见2例(2.2%)(为了便于分析，我们将CLL/PL及混合型CLL均归为混合细胞型CLL组)。所有患者骨髓象增生度均达活跃-极度活跃，淋巴细胞比例明显增高，多为类似成熟的小淋巴细胞，伴有不同比例的幼稚淋巴细胞、粒系、红系及巨核系表现不同程度减少。

2 免疫表型检测结果 89例CLL 患者抗原表达阳性率由高至低依次为CD1998.9%(88/89)、HLA-DR 97.8%(87/89)、CD588.8%(79/89)、CD2085.4%(76/89)、CD2271.9%(64/89)、CD2361.8%(55/89)、CD3839.3%(35/89)、FMC-7 11.2%(10/89)、CD32.2%(2/89)；无1例表达CD7及CD10。

3 细胞形态学分型与免疫表型的关系 典型CLL与混合细胞型CLL两组间CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC-7及HLA-DR阳性表达率无统计学差异(P均>0.05)而混合型CLL中CD38阳性表达的比例明显高于典型CLL组，差异有明显的统计学意义(P<0.05)，见附表。

附表 典型CLL与混合型CLL免疫表型比较[n(%)]

4 预 后 有完整随访资料的患者69例，死亡15例。其中典型CLL 53例，6例死亡，中位生存期为118个月，混合细胞型CLL 16例，死亡9例，中位生存期63个月，经Long-rank检验，两组生存期差异具有统计学意义(P<0.01)。15例死亡病人中CD38阳性表达10例，存活患者54例中CD38阳性表达15例，经χ2检验死亡患者与存活者之间CD38阳性表达存在明显的统计学差异(P<0.05)。

讨 论

慢性淋巴细胞白血病(CLL)属慢性B淋巴细胞增殖性疾病，外周血/骨髓细胞形态学检查是CLL最基本及主要的诊断方法。根据幼稚淋巴细胞在淋巴细胞中所占的不同比例可将CLL分为三种亚型。①典型CLL：90%以上为类似成熟的小淋巴细胞；②CLL伴随幼淋细胞增多(CLL/PL)：幼稚淋巴细胞>10%,但<54%。③混合细胞型：有不同比例的不典型淋巴细胞，幼稚淋巴细胞<10%。本组89例CLL患者中72例(80.9%)为典型CLL，形态学表现以体积较小的类似成熟小淋巴细胞为主；15例(16.9%)为CLL/PL，形态除见小淋巴细胞外，还可见到11～52%的幼稚淋巴细胞，该类细胞胞体较大，核染质细致，可见核仁1～2个，胞质量较丰富；混合型CLL 2例(2.2%)，幼稚细胞胞体较大，核浆比减低，胞浆呈不同程度嗜碱性。本研究将CLL/PL及混合细胞型CLL均归为混合细胞型CLL，本文混合细胞型CLL占所有病例19.1%，与文献报道大致相符。Baeso-Ramos等[3]研究认为，混合型CLL细胞具有较强的增殖和凋亡活性，患者更易发生克隆性染色体异常，预后较差。本研究证实混合细胞型CLL生存期较典型CLL短，是独立的预后不良因素之一，因此瘤细胞形态特征不仅是CLL诊断的主要指标，而且对预后评估也具有重要意义。

细胞免疫分型是诊断血液恶性肿瘤的重要参考指标之一，它对CLL的诊断、鉴别诊断及预后判断具有重要意义，慢性淋巴细胞白血病(CLL) 是一种B 淋巴细胞肿瘤，CLL 细胞主要的表型特点是 CD5阳性 B 细胞， 即CD5+CD19+，同时表达CD23、CD20， 弱表达CD22， 不表达CD79b ，FMC7。 本研究中CLL 抗原表达阳性率最高的是CD1998.9%及H LA-D R 97.8%；其次为CD588.8%、CD2085.4%、CD2271.9%；CD23、 CD38则分别为 61.8%和39.3%；由此可见大部分CLL同时表达CD19、CD5、CD20及CD22，它们可作为CLL诊断的重要依据。一般认为，CD5+是CLL的重要特征，但是确实存在少数CD5阴性CLL。Inamdar 等[4]报道7 %～20 %的 CLL 患者不表达CD5。本研究89例CLL患者中有10例(11.2%)为CD5阴性，与Inamdar 等结果相一致，因此对于CD5阴性而CD19和CD20阳性的患者，在诊断时应谨慎，需结合细胞形态学，遗传学及临床表现综合分析判断。

CD38表达与预后的关系尚不明确，有学者认为CD38表达与预后呈负相关。Gentile等[ 5]对242例患者进行研究发现 CD38+与 CD38-相比，男性多于女性, 血红蛋白和血小板计数显著减少 ,淋巴细胞计数明显增加，CD38+患者PFS较CD38-者明显缩短, 对化疗药物反应差 , 病情进展迅速 , 完全缓解率低 。CD38+还是疾病侵袭性的一个重要标志, 无论患者的临床分期如何，即使处于Rai分期的0期,CD38+患者亦常具有明显的侵袭性。本研究结果显示典型CLL与混合型CLL两组之间CD38阳性表达差异有统计学意义，而且死亡患者与存活患者之间CD38表达也存在明显的差异，提示CD38阳性表达时预后较差，CD38可作为判断CLL患者的预后指标。易莎等[6]研究报道60.42%CLL患者CD38阳性表达。本文CD38阳性率39.3%较易莎研究结果低，可能与病例数较少有关，有待今后继续研究。

[1] Hoster E，Dreyling M,Klapper W,etal.A new prognostic index(MIPI) for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma[J].Blood,2008,111:558-565.

[2] 张之南，沈 悌 . 血液病诊断及疗效标准 [M]. 3版.北京: 科学出版社 , 2007: 139-144.

[3] Bueso-Ramos CE,Ferrajoli A,Medeiros LJ,etal.Aberrant morphology,proliferation,and apoptosis of B-cell chronic limphocytic leukemia cells[J].Hematology,2004,9:279-286.

[4] Inamdar KV,Bueso-ramos CE.Pathology of chronic lymphocytic leukemia:An update[J]. Annals of Diagnostic pathology,2007,11:363-389.

[5] Gentile M,Mauro FR,Calabrese E,etal.The prognostic value of CD38 expression in chronic Lymphocytic leukemia patients studied prospectively at diagnosis: A single Institute experience[J].Br J Haematol , 2005, 130(4) : 549 - 557.

[6] 易 莎，张小斌，陈 燕. 103例慢性淋巴细胞白血病患者免疫表型的研究[J].临床血液学杂志，2010,23(3)：86-88.

(收稿：2016-03-14)

The research on the value of cell morphology combined with immunophenotyping test in the diagnosis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068) Han Xiurui Yang Didi Zhang Lijie et al

Objective: To investigate cell morphology and immunophenotypes characteristics of CLL patients and to understand the relationship between them .Methods: Immunophenotyping of bone marrow and blood specimens was performed in 89 CLL patients by flow cytometry, meanwhile the patients were divided into the typical CLL group and the mixed CLL group according to the analysis of cell morphology. We compared the antigen expression differences between the two groups, and thus analyzed the impact of the differences on prognosis. Results: In all patients, the rates of antigen expression from high to low were CD19(98.9%), HLA-DR(97.8%), CD5(88.8%), CD20(85.4%)，CD22(71.9%),CD23(61.8%),CD38(39.3%), FMC-7 (11.2%)and CD3(2.2%) . For cell morphologic classification of 89 cases, 72 (80.9%) cases were typically CLL and 17(19.1%) cases mixed CLL. There was significant difference in the expression of CD38between the typical CLL and mixed CLL group . There were no significant differences in the expressions of CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, HLA-DR, FMC-7 between the two groups . Prognostic analysis showed that the survival time of mixed CLL patients was shorter than that of typical CLL patients (P<0.01), the difference of the expression of CD38between the deceased and survived patients was statistically significant .Conclusion: The combination of cell morphology and phenotype analysis is not only the main means of CLL diagnosis and differential diagnosis, and also has great value for prognosis estimation.

Leukemia,lymphocytic,chronic,B-cell/diagnosis Immunophenotyping Bone marrow cells Prognosis

*陕西省社会发展攻关基金资助项目(2011K12-23)

白血病，淋巴细胞,慢性B-细胞/诊断 免疫表型分型 骨髓细胞 预后

R

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.049

△通讯作者