耐酸酵母的分离鉴定及在丢糟发酵中的应用

李彦芹，崔海灏，李春青，宋瑞雪，陈亚军

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北十里香酒业股份有限公司 工程技术研究中心，河北 泊头 062150)



耐酸酵母的分离鉴定及在丢糟发酵中的应用

李彦芹1，崔海灏2，李春青1，宋瑞雪2，陈亚军1

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北十里香酒业股份有限公司 工程技术研究中心，河北 泊头 062150)

从白酒丢糟及酒醅中分离得到2株酵母菌YP2、YZ13，两株菌均能在pH 3.0条件下正常生长，经鉴定YP2为Candida属，与Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%；YZ13为Pichia属，与Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%.2株酵母(种子液体积比1∶1)应用于丢糟发酵中，接种量100 mL/kg，在鲜丢糟870 g/kg、麸皮100 g/kg、硫酸铵15 g/kg、生石灰15 g/kg，28 ℃混合固态发酵60 h，丢糟(干样)的真蛋白含量达172.30 g/kg，比发酵前丢糟(干样)提高了28.29%，丰富了丢糟饲料蛋白，为丢糟发酵和高效饲料提供了依据.

酵母菌；耐酸性；真蛋白

丢糟是白酒生产的主要副产物及主要污染物，丢糟中含有丰富的蛋白、淀粉、氨基酸及各种微量元素等，但因其生产工艺丢糟的酸度高、含水量高、易腐败变质，若不及时处理，必然会造成环境严重污染.许多企业将固态白酒丢糟直接用作饲料，但丢糟鲜饲料存在营养结构缺陷及低消化利用率的缺点，同时储存和运输难[1-2].酵母细胞含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素和脂肪等，白酒丢糟经酵母发酵后具有较高的营养价值，并且多数酵母具有特殊香味，通过酵母菌发酵代谢，可弥补改善丢糟鲜饲料缺陷，增强口感，提高白酒丢糟利用率，并且一定程度上利于牲畜消化吸收[3-4].

以白酒企业酒醅及丢糟为材料，分离得到2株耐酸酵母，应用于白酒丢糟的发酵，为制备白酒丢糟蛋白饲料提供依据，为白酒产业循环经济发展模式提供借鉴.

1 材料

1.1 酒醅和丢糟

白酒企业提供酒醅和丢糟.

1.2 培养基

PDA培养基[5]；YPD培养基[6]；丢糟固态培养基：以鲜丢糟为主要成分，适当添加辅料.

2 方法

2.1 酵母菌的分离与纯化

分别取10 g新鲜酒醅或丢糟于90 mL无菌生理盐水中，摇床振荡 30 min充分混匀，进行系列稀释，取一定量稀释液均匀涂布于PDA固体培养基(pH 4.0)、YPD固体培养基(pH 4.0)、丢糟平板(pH 4.0，20 g/L干糟粉+15 g/L琼脂粉配制)，28 ℃恒温培养2～3 d，出现单菌落，进一步平板划线纯化得到纯菌，PDA斜面保存备用.

2.2 酵母菌的鉴定

形态及生理生化鉴定方法参照文献[6]进行；酵母菌分子鉴定委托保定迈禾斯生物科技有限公司进行测试.

2.3 耐受性实验

2.3.1 pH耐受实验

用乳酸调节YPD 液体培养基 pH 值分别为 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 、5.5、6.0，培养 2～3 d，观察生长差异.

2.3.2 耐高温实验

YPD固体培养基，采用平板点种法，培养温度设为25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，培养 2～3 d，观察生长差异.

2.3.3 乙醇耐受实验

将灭菌后的 YPD 液体培养基，每L加入40、50、60、70、80、90、120、140、160、180 mL的无水乙醇接种培养，连续观察1周.

2.3.4 耐盐性

YPD 液体培养基，加入NaCl,使NaCl的质量浓度分别为10、30、50、70、100、150、200 g/L，进行接种培养，连续观察1周.

2.3.5 耐糖性

用葡萄糖的质量浓度为200、300、400、500、600 g/L的 YPD 液体培养基培养，连续观察2周.

2.4 酵母菌在丟糟中的应用

2.4.1 种子液的制备

酵母接种到PDA斜面培养基上，在28 ℃恒温培养48 h后，再接种到50 mL三角瓶 20 mL PDA液体培养基中，于28 ℃恒温摇床(200 r/min)培养48 h用做种子液.

2.4.2 生石灰添加量对真蛋白含量的影响

纯鲜酒糟作为基础发酵培养基，用生石灰调节发酵培养基的起始pH值，生石灰的添加量分别为0、5、10、15、20 g/kg，酵母菌(种子液体积比1∶1)按100 mL/kg的接种量接种到发酵培养基中，发酵2 d后，测定其真蛋白的含量.

2.4.3 麸皮添加量对真蛋白含量的影响

在鲜酒糟加生石灰调节pH为最适作为基础发酵培养基条件下，麸皮(麸皮的含水量与酒糟一致)添加量分别为40、60、80、100、120 g/kg，酵母菌(种子液体积比1∶1)按100 mL/kg的接种量接种到发酵培养基中，发酵2 d后，测定其真蛋白的含量.

2.4.4 硫酸铵添加量对真蛋白含量的影响

在鲜酒糟添加适量麸皮、生石灰调节pH为最适条件下，硫酸铵添加量分别为5、10、15、20、25 g/kg，酵母菌(种子液体积比1∶1)按100 mL/kg的接种量接种到发酵培养基中，发酵2 d后，测定其真蛋白的含量.

2.4.5 发酵时间对真蛋白含量的影响

在鲜酒糟添加适量麸皮、硫酸铵和生石灰调节pH为最适条件下，酵母菌(种子液体积比1∶1)按100 mL/kg的接种量接种到发酵培养基中，发酵时间分别为24、36、48、60、72 h，发酵结束后测定其真蛋白的含量.

2.4.6 真蛋白的测定方法

取样品1 g(湿重)加30 mL 体积分数为75%的乙醇浸泡1 h，于4 000 r/min下离心10 min，弃去上清液，将沉淀于60 ℃恒温烘箱中烘至恒重，消化处理，利用微量凯氏定氮法进行测定，计算真蛋白含量[7-9].

3 结果与讨论

3.1 酵母菌分离与鉴定

3.1.1 酵母菌的形态特征

经稀释涂布平板和平板划线法得到2株酵母菌编号为YZ13、YP2.YZ13液体培养表面形成白色菌膜，个体呈椭圆、柱状、管状，多边芽殖，大小(1.5～4.0) μm×(4.0～20) μm，YZ13菌落湿润，无光泽，中间有突起，形成假菌丝(图1、2、3).YP2液体培养浑浊并有沉淀，个体圆形、椭圆，多边芽殖，大小(2.0～3.5) μm×(2.0～7.0) μm，YP2菌落湿润，有光泽，中间突起，形成假菌丝(图4、5、6).

图1 YZ13 菌落形态Fig.1 Colony morphology of YZ13(×12)

图2 YZ13菌体形态Fig.2 Morphology of YZ13 cell(×1000)

图3 YZ13 假菌丝Fig.3 Pseudomyceliaof YZ13(×100)

3.1.2 生理生化鉴定

氮源同化实验结果见表1，糖发酵实验结果见表2，碳源同化实验鉴定结果见表3.其他生理生化实验结果表明，YZ13 、YP2均不液化明胶，不形成类淀粉化合物.

图4 YP2 菌落形态(5 d)Fig.4 Colony morphology of YP2(×12)

图5 YP2 菌体形态Fig.5 Morphology of YP2 cell(×1000)

图6 YP2 假菌丝Fig.6 Pseudomycelia of YP2(×100)

氮源YZ13YP2硫酸铵++尿素++硝酸钾--

+阳性；-阴性.

表2 糖发酵实验结果

+发酵；-不发酵.

表3 碳源同化实验结果

+阳性;-阴性.

3.1.3 酵母菌的分子鉴定

酵母ITS DNA采用ITS1/ITS4引物进行扩增，扩增产物测序，利用NCBI-Blast 软件对酵母 ITS DNA序列进行分析，YZ13与Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%，YP2与Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%(图7).

图7 2株酵母基于rDNA-ITS序列的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of two yeast strains YP2 and YZ13 based on rDNA-ITS sequences

3.2 酵母菌耐受性实验

酵母菌耐变性实验结果见表4～8.YZ13与YP2菌株在pH 3.0以上均能正常生长，YZ13对高温、高糖、高盐、高体积分数乙醇有很好的耐受性，但因不同菌株之间营养要求不同，代谢上互补，将2株菌混合应用于丟糟发酵.

表4 耐酸性测定结果

表5 耐温测定结果

+生长一般；++生长好；+++生长较好； -不生长.

+生长；-不生长.

表7 耐盐测定结果

+生长；-不生长.

表8 耐糖测定结果

+生长；-不生长.

3.3 酵母菌在丢糟发酵中的应用

3.3.1 生石灰添加量的影响

在鲜丢糟中生石灰添加质量分数分别为0、5、10、15、20 g/kg，28 ℃发酵2 d后测定其真蛋白质量分数，其结果见图8.丢糟初始pH为2.5，随生石灰添加质量分数的增加真蛋白质量分数增高，生石灰添加质量分数达15 g/kg时真蛋白质量分数最高，达168.10 g/kg，随后又有所下降.生石灰添加15 g/kg时丢糟pH在6.0～6.5，有利于酵母菌的生长.

图8 生石灰添加质量分数对真蛋白质量分数的影响Fig.8 Quicklime’s effect on mass fraction of true protein

3.3.2 麸皮添加量的影响

在鲜丢糟中添加麸皮分别为40、60、80、100、120 g/kg，生石灰调节pH为6.0，28 ℃发酵2 d后，测定其真蛋白的质量分数，其结果见图9.在麸皮添加质量分数为100 g/kg时，真蛋白达160.10 g/kg.

3.3.3 硫酸铵添加量的影响

在鲜丢糟中添加麸皮质量分数为100 g/kg，生石灰调节pH为6.0，硫酸铵添加质量分数分别为5、10、15、20、25 g/kg，28 ℃发酵2 d，测定其真蛋白的质量分数，其结果见图10.

图9 麸皮添加质量分数对真蛋白质量分数的影响Fig.9 Wheat bran’s effect on mass fraction of true protein

图10 硫酸铵添加质量分数对真蛋白质量分数的影响Fig.10 Ammonia sulfate’s effect on mass fraction of true protein

硫酸铵添加质量分数为15 g/kg时真蛋白质量分数最高,达166.10 g/kg.由于氮是组成蛋白质的重要元素，所以氮源对微生物的生长和代谢有着重要的作用，微生物可以利用外来氮源自行合成所需的氨基酸，形成自身的菌体蛋白，从而提高真蛋白质量分数.

3.3.4 发酵时间的影响

在鲜丢糟中麸皮添加质量分数为100 g/kg，生石灰调节pH为6.0，硫酸铵添加质量分数为15 g/kg，发酵时间分别为24、36、48、60、72 h，测定其真蛋白的质量分数，结果见图11.

在发酵时间达60 h时真蛋白的质量分数最高，达172.30 g/kg，60 h之后趋于稳定并有衰减趋势.随着发酵的进行，营养物质减少，菌体增值能力下降，有些菌体衰败菌体自溶，所以后期出现微量的真蛋白衰减.

图11 发酵时间对真蛋白质量分数的影响Fig.11 Fermentation time’s effect on mass fraction of true protein

4 结论

采用稀释涂布和平板划线法从白酒丢糟及酒醅中分离得到2株酵母菌YZ13、YP2，均能在pH 3.0条件下正常生长，经鉴定YZ13为Pichia属，与Pichiakudriavzevii(LC014798.1)相似度100%，YP2为Candida属，与Candidapseudolambica(KM384061.1)相似度98%.YZ13耐酸、耐盐、耐乙醇、耐糖、耐高温均高于YP2.2株酵母混合应用于丢糟发酵中，使丢糟(干样)的真蛋白质量分数达172.30 g/kg，比发酵前丢糟(干样)提高了28.29%，丰富了丢糟饲料蛋白.

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(责任编辑：赵藏赏)

Separation and identification of acid proof yeast and its application in fermentation of waste fermenting grains

LI Yanqin1，CUI Haihao2，LI Chunqing1，SONG Ruixue2，CHEN Yajun1

(1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Research Center of Engineering Technology,Wine Company Limited Hebei Shilixiang，Botou 062150，China)

The two yeaststrainsYP2 and YZ13 were isolated from Chinese-spirit fermenting grains and they could all grow well under the condition of pH 3.0.Strain YP2 was identified as belonging toCandidaand the similarity degree of strain YP2 andCandidapseudolambica(KM384061.1) reached 98%，while strain YZ13 toPichiaand the similarity degree withPichiakudriavzevii(LC014798.1)reached 100%.The two strains were mixed at the ratio of 1∶1 in weight and applied to the fermentation of waste fermenting grains.The process of solid state fermentation lasted for 60 hours under the condition of inoculation quantity 100 mL/kg，fresh fermenting grains 870 g/kg，wheat bran 100 g/kg，ammonia sulfate 15 g/kg，quicklime 15 g/kg，temperature 28 ℃.The results showed that the protein content of the dry sample of waste fermenting grains reached 172.30 g/kg and increased by 28.29% and it enriched feed protein of waste fermenting grains and provided foundation for waste fermenting grains and high efficiency feed.

yeast；acid proof；true protein

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.011

2015-07-05

河北大学横向课题(2016-01)

李彦芹(1965—)，女，河北满城人，河北大学副教授，主要从事微生物和免疫学研究.E-mail:li13102929@126.com

X172;X797

A

1000-1565(2016)05-0517-07