实验室检测奶牛结核病的方法比较

安先霞林学仕

(1.永靖县川城镇畜牧兽医站,甘肃永靖 731600; 2.永靖县动物疫病预防控制中心,甘肃永靖 731600)

实验室检测奶牛结核病的方法比较

安先霞1林学仕2

(1.永靖县川城镇畜牧兽医站,甘肃永靖 731600; 2.永靖县动物疫病预防控制中心,甘肃永靖 731600)

奶牛结核病属于人畜共患传染病，该病严重危害奶牛养殖业和公共卫生安全，是由牛结核分枝杆菌引起，奶牛是家畜中最易感染该病的动物。多年来，奶牛结核病已成为制约奶牛养殖业发展和危害人类健康的重要因素。为了更好地防控奶牛结核病，用两种方法检测结核病：牛型提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应和γ-干扰素检测技术检测比较，分析其优劣，为以后的检测工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒

瑞士Prionics公司Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA检测试剂盒，购买于北京测迪科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

牛结核菌素由哈药集团生物疫苗有限公司生产，Bovigam牛型提纯结核菌素（BoPPD）和Bovigam禽型提纯结核菌素（AvPPD）购买于北京测迪科技有限公司。

1.1.3 试验牛群

选择全县饲养的531头奶牛，从2014年开始到2016年，每年3～4月份和9～10月份，进行结核病检测。

1.2 方法

1.2.1 牛型提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应试验

依据国家标准《动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002）》，在奶牛颈部用牛型PPD进行皮内变态反应试验，剂量为2000IU/头，分别在注射前和注射后72h测量皮肤厚度，并计算出皮厚差，对于皮厚差在2.0mm以上的（包括2.0mm）疑似阳性牛再进行对侧重复检查，依据国家标准判断结果。

1.2.2 牛结核γ-干扰素检测试验

皮内试验第3d采集单侧阳性牛的血液（每头6ml），放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒3～5次，使肝素和血液充分混匀，放入22℃恒温箱中，运送到实验室，并在采血后第20h进行培养。轻轻颠倒试管10次，在无菌条件下，用一次性自动移液器将抗凝血加入24孔组织培养板，每头奶牛加3孔1.5ml血样。每个血样3个孔分别加入100μlPBS、禽型提纯结核菌素、牛型结核菌素将含有血液和抗原的组织培养板在37℃恒温培养箱中孵育21.5h。孵育后将24孔板在室温下（25℃），500rmin，离心lOmin，小心吸取上层血浆，放入1.5ml的离心管中。然后按照试剂盒说明对γ-干扰素上清液进行检测。结果判定标准：阴性=牛型提纯结核菌素的OD-阴性抗原的OD＜0.1或牛型提纯结核菌素的OD-禽型提纯结核菌素的OD＜0.1。阳性=牛型提纯结核菌素的OD-阴性抗原的OD≥0.1且牛型提纯结核菌素的OD-禽型提纯结核菌素的OD≥0.1。

2 结果

（1）牛型提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应试验选定永靖县39个奶牛养殖场（户）饲养的531头奶牛进行结核病检疫净化，每年3～4月份和9～10月份分为两次进行集中检测，累计检测3140头次。检出疑似阳性牛11头，在颈部对侧复检的同时，采集血液样本。通过皮内变态反应法复检排除疑似阳性牛4头，实际阳性牛为7头，奶牛结核阳性率0.22%。（详见表1）

表1 2014～2016年全县奶牛结核病检测统计表 单位：头、%

（2）牛结核γ-干扰素检测试验

通过牛结核γ-干扰素检测技术对11头疑似阳性牛进行实验室血清学检测，排除假阳性奶牛6头，最终确定结核阳性牛5头，奶牛结核阳性率0.16%。

表2 γ-干扰素技术与PPD皮内变态反应技术的比较

3 讨论

本试验结果表明：γ-干扰素试验与皮内变态反应相比，特异性好和灵敏度高，但是该方法成本较高，目前不适合全面推广使用。国内已经开始研发低成本的γ-干扰素牛结核病诊断试剂盒，该试剂盒研发成功后将改变我国牛结核病的诊断方法。

4 结论

γ-干扰素检测技术是一种新型牛结核病检测方法，具有检测结核病早期感染的能力，通过体外刺激培养，检测只需要采集一次血样，而且试验特异性好，检测敏感性高。商品化牛结核下γ-干扰素试验试剂盒，容易实现标准化，排除了PPD变态反应结果判定人为因素影响。但是牛结核分枝杆菌下一干扰素检测试剂盒价格较高，建议目前将该方法用于复核检查牛型PPD变态反应阳性牛，剔除部分假阳性牛型PPD反应，尽量减少不必要的经济损失。