清肠化湿方对溃疡性结肠炎患者外周血T淋巴细胞亚群的影响

赵 崧， 陆玥琳， 冯 皖， 沈 洪

(江苏省中医院消化科， 江苏 南京 210029)

清肠化湿方对溃疡性结肠炎患者外周血T淋巴细胞亚群的影响

赵 崧， 陆玥琳， 冯 皖， 沈 洪

(江苏省中医院消化科， 江苏 南京 210029)

目的:探讨中药清肠化湿方对溃疡性结肠炎患者外周血T淋巴细胞亚群的影响。方法:收集江苏省中医院门诊及住院治疗的21例湿热内蕴证轻型溃疡性结肠炎患者，采用中药清肠化湿方口服加灌肠治疗，疗程3个月。观察单用中药的疗效，应用特异性细胞固定及检测法比较治疗前后患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，以配对t检验进行统计分析。结果:清肠化湿方治疗后与治疗前比较患者外周血CD3＋及CD4＋细胞数差异无统计学意义(P＞0.05)；CD8＋细胞数治疗后与治疗前相比降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治疗后与治疗前相比升高，差异具有统计学意义(P＜0. 05)。结论:中药清肠化湿方对溃疡性结肠炎患者外周血T淋巴细胞亚群具有调节作用，通过调整机体免疫反应抑制肠道炎症。

清肠化湿方； 溃疡性结肠炎； T淋巴细胞亚群

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以结直肠的慢性复发性炎症为特征的疾病，中医学认为UC活动期的病机较多存在大肠湿热，该证型的主要治法为清化肠道湿热。清肠化湿方是本院沈洪教授以芍药汤为主方，并且结合多年用药经验及单味中药筛选实验逐步优化而来的验方，在临床中已取得较好的疗效，并在前期研究中证实能够抑制UC患者Th17细胞的生成与活化[1]。本实验拟通过UC患者外周血T细胞亚群的分析，探讨清肠化湿方对UC患者免疫反应的影响。

1　资料与方法

1.1诊断标准及中医辨证分型标准:UC诊断参照《炎症性肠病诊断与治疗共识意见》[2]。中医辨证分型参照《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》[3]。

1.2纳入标准:符合UC临床诊断标准；且中医辨证属湿热内蕴证；年龄18～65岁。排除以下情况:感染性结肠炎包括细菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸虫病、肠结核等；克罗恩病、缺血性肠炎、放射性肠炎患者；有严重并发症如局部狭窄、肠梗阻、肠穿孔、中毒性结肠扩张、大出血、结直肠癌患者；具有其他原发性、继发性感染性疾病患者。

1.3一般资料:临床病例为2015年1月至2015年9月江苏省中医院脾胃病科门诊及住院的41例UC活动期患者，男20例，女21例，年龄20～60岁(中位年龄40.5岁)，病程0.5～6.0年。按Baron分级标准评定内镜下黏膜表现[4]，组织学分级由本院2位病理科医生阅片评定。41例UC活动期患者中选择属于轻度且中医辨证属湿热内蕴证者21例，年龄24～59岁(中位年龄42.6岁)，病程0.5～6.0年。21例患者纳入研究前的3个月内均未使用过美沙拉嗪及糖皮质激素。本研究所涉及的伦理问题经江苏省中医院伦理委员会审核通过，并且所得外周血样品得到患者的知情同意。

1.4治疗方法:清肠化湿方，药物组成:黄连6g，黄芩10g，白头翁10g，煨木香10g，炒白芍20g，炒当归10g，肉桂3g(后下)，生甘草6g。水煎服，每天1剂，临床可根据病情变化随证加减；配合灌肠方(黄柏30g，石菖蒲20g，苦参10g，地榆30g，白及9g，三七粉3g，诃子10g，锡类散1.5g)，浓煎至120mL，每晚睡前灌肠1次，连续灌肠12d后停灌2d，中药饮片由江苏省中医院药房提供；锡类散为南通精华制药股份有限公司生产，每支1.5g，批号:51160101。疗程为3个月。

1.5检测指标及方法:疗效判定:①完全缓解:患者临床症状、体征完全消失，内镜下表现肠道黏膜无异常；②有效:临床症状、体征基本消失，内镜下表现可见肠道黏膜轻微的炎性改变；③无效:患者临床症状、体征无改善，甚至加重。总有效率＝(完全缓解例数＋有效例数)/总例数×100%。治疗前后患者外周血T淋巴细胞亚群分析:采用上海汇中细胞生物科技有限公司SemiBio CD系列(CD3/4/8)细胞检测玻片分析。取患者静脉血标本，吸取20μL摇匀，EDTA抗凝全血加入380μL磷酸盐缓冲液中，即刻混匀。将湿盒置于水平工作台，加入室温水直至湿盒底部被完全覆盖。取出玻片，吸取5μL稀释血样，滴入玻片方框区域中央。盖紧盒盖，室温孵育40min，将玻片按序插入玻片架，放入磷酸盐缓冲液中，直至玻片呈无色透明。即刻放入过氧化酶染色液中，静置1min。将略干燥后的玻片架放入新鲜的过氧化氢溶液中，静置4min。再将玻片架转入75%乙醇中清洗至干净。将玻片置于SemiBio自动玻片干燥仪下干燥6min，放入复染液中，静置1min。转入纯水中，静置30s，吹干。通过SemiBio全自动可视化细胞检测仪进行细胞自动计数、分析。该检测方法正常参考值:CD3＋细胞绝对计数770～2860个/μL，CD4＋细胞绝对计数414～1440个/μL，CD8＋细胞绝对计数238～1250个/μL，CD4＋/CD8＋比值0.7～2.87。

1.6统计学方法:应用SPSS19.0统计软件，计量资料以±s表示，治疗前后各指标比较采用配对t检验，统计作图采用GraphPad Prism 6。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

图1　治疗前后CD3＋细胞比较

图2　治疗前后CD4＋细胞比较

图3　治疗前后CD8＋细胞比较

图4　治疗前后CD4＋/CD8＋比较

2.1临床疗效观察:21例患者其中有1例患者实验期间加用美沙拉嗪治疗，判定为病例脱落。20例患者单纯使用清肠化湿方治疗，其中12例完全缓解，6例有效，2例无效。总有效率达90%。

2.2患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较。患者治疗后与治疗前比较外周血CD3＋及CD4＋细胞数差异无统计学意义(P＞0.05)；CD8＋细胞数治疗后与治疗前相比降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治疗后与治疗前相比升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(见表1及图1～4)

表1　患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较(±s)

表1　患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较(±s)

时间CD3＋(个/μL)CD4＋(个/μL)CD8＋(个/μL)CD4＋/CD8＋治疗前1381.50±292.15 711.45±153.29 593.95±119.44 1.21±0.19治疗后1376.90±268.27 718.10±164.34 511.50±102.69 1.41±0.23 t0.18760.36455.2136.012 P0.85310.7195＜0.001＜0.001

3　讨 论

本试验中患者外周血T淋巴细胞分析采用特异性细胞固定及检测法，以细胞分离固定技术为基础，利用抗原抗体特异性反应，通过芯片基板达到将特异性细胞进行固定、分离的目的，完成检测。该方法与流式细胞术结论相关性良好，检测结果无明显差异，同时其操作简单，使用条件不苛刻。从检验学角度，细胞绝对值比百分率更具有临床价值。除了获得细胞数量外，玻片可固定细胞，直接观察细胞形态对其分析。

CD3＋细胞主要参与T细胞信号转导，但整体水平基数较大，进一步标记的分类繁多，故不足以在治疗前后显示出差异。人体肠道内的免疫系统由复杂的免疫细胞族群构成，既能够对肠腔抗原形成生理免疫耐受，又可以提供抵御致病原的能力。固有免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)与适应性免疫细胞(T细胞和B细胞)在黏膜中的异常渗透是活动期UC的标志性变化。CD4＋的效应T细胞(Th1，Th2和Th17)是对抗病原体的关键，而调节性T细胞可以限制效应T细胞的无限扩大和过度反应。调节性T细胞发展缺陷或者免疫抑制属性的改变将导致T细胞介导的免疫耐受丧失，最终平衡打破从而形成结肠炎症。清肠化湿方在本实验中虽然取得较好疗效，结肠炎症减轻，但治疗前后外周血CD4＋细胞数并未表现出显著变化。可能由于CD4＋的效应T细胞与调节性T细胞的此消彼长，结果从整体水平上变化微弱，所以从CD4＋细胞的更具体分类亚群角度进行研究或许可以获得进一步的数据。

细胞毒性T细胞和CD8表面蛋白被称为CD8＋T细胞，CD8＋细胞能够识别抗原，通过释放穿孔素与颗粒酶发挥毒性杀伤作用将靶细胞溶解。UC患者的CD8＋细胞水平较高，可引发自身免疫炎症，造成肠道组织损伤。同时细胞毒性T细胞还能够产生和释放促炎细胞因子以及化学因子，例如干扰素γ或者肿瘤坏死因子α，这些因子协助导致上皮细胞溶解，在上皮受到侵蚀的位置造成肠腔内抗原的注入。治疗后患者的CD8＋细胞数明显降低，CD4＋/CD8＋比值明显升高，阐明了清肠化湿方对于UC患者免疫状态调节的正面作用。

[1] 陆玥琳，沈洪，姚宏凤，等.清肠化湿方联合美沙拉嗪颗粒对溃疡性结肠炎患者血浆及肠黏膜组织IL－17的影响[J].中国中西医结合杂志，2014，34(10):1160～1163

[2] 中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组.炎症性肠病诊断与治疗的共识意见[J].胃肠病学，2012，17(12):763～781

[3] 中华中医药学会脾胃病分会.溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见[J].中华中医药杂志，2010，25(6):891～895

1006－6233(2016)11－1920－03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.073

江苏省中医院院级课题项目，(编号:Y13053)；国家中医临床研究基地业务建设第二批科研专项，(编号: JDZχ2015083)