运动训练和白藜芦醇保护NAFLD大鼠肝细胞凋亡的内质网应激机制研究

阮 凌，李方晖



运动训练和白藜芦醇保护NAFLD大鼠肝细胞凋亡的内质网应激机制研究

阮 凌1，李方晖2

目的：研究运动训练和白藜芦醇(RVS)干预对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血脂代谢、肝细胞凋亡及内质网应激(ERS)相关蛋白表达的影响。方法：将SPF级雄性SD大鼠70只分为普通安静对照组(NC)、NAFLD模型组(HF)、HF小强度耐力运动组(LE)、HF中等强度耐力运动组(ME)、HF递增强度耐力运动组(IE)、HF白藜芦醇组(RVS)、中等强度耐力运动联合RVS组(RE)，共7组，每组各10只。运动组每次运动时间60 min，每周运动5天。RVS灌胃按照40mg/kg/天，每周7天。干预6周后测试血脂指标和分析肝组织HE切片；免疫组化测试Bax、Bcl-2蛋白表达；TUNEL测试肝细胞凋亡情况；采用Western-blot检测肝组织ERS 相关因子GRP78、Caspase3、IRE1、p-IRE1、JNK1、CHOP、PERK和eIF2α蛋白表达。结果：与HF组相比，所有干预组均降低NAFLD大鼠血清TG、TC、FFA、LDL-c含量和肝细胞的凋亡率和Bax蛋白表达，同时增加了HDL-c含量和Bcl-2表达；与HF组相比，内质网跨膜蛋白IRE1、PERK蛋白表达和GRP78/Caspase3比值显著增加，Caspase3、p-IRE1、eIF2α、JNK1和CHOP蛋白表达显著降低，综合运动组中各指标发现，ME组较LE和IE效果好，而RE组则优于其他各组。结论：1)16周高脂饮食可复制NAFLD大鼠模型，NAFLD大鼠肝细胞凋亡的发生与ERS同时激活IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP两条信号通路有关；2)不同强度耐力运动对NAFLD大鼠血脂各项指标和肝细胞凋亡均有不同程度的改善作用，但中等强度耐力运动优于其他运动组，这可能依赖于对ERS信号途径IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP双重调控；3)RVS对NAFLD大鼠肝细胞凋亡也具有改善作用，但并非依赖于对ERS凋亡途径的调控；4)联合干预组对ERS信号通路IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP也具有双重抑制作用，且优于中等强度耐力运动组。

运动训练；白藜芦醇；非酒精性脂肪肝；凋亡； 内质网应激

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，但肝实质细胞发生脂肪性变和脂肪贮积为主要特征的临床病理综合症。流行病学调查显示，在西方国家有将近30%的成人和10%的儿童患有NAFLD。研究表明，NAFLD与心血管事件的发生、肝脏及肿瘤相关的死亡率增加密切相关[9]。近年来研究证实，肝细胞凋亡在NAFLD发展进程中扮演重要角色。文献报道，NAFLD患者胆固醇代谢异常和脂肪酸堆积常会导致肝细胞损伤及凋亡，这与肝脏枯否细胞(Kupffer cells，KCs)和肝卫星细胞内凋亡信号通路的激活有关；此外，KCs和肝卫星细胞的激活和凋亡同时又进一步加速了肝脏组织损伤、纤维化和慢性炎症的进程[9]。总之，减少肝脏组织的胆固醇生物合成、保护因脂毒性导致的肝细胞氧化损伤及其凋亡是抑制NAFLD肝脏纤维化与炎症、防止肝脏癌变的重要途径。

普遍认为，细胞凋亡的发生机制有3条途径，即死亡受体介导的凋亡途径、线粒体途径和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)驱动的凋亡途径。研究发现，适度的ERS在调控细胞内蛋白质稳态过程中扮演重要角色；但应激时间过长或程度过强时，细胞内的蛋白质稳态无法恢复，便通过ERS诱导细胞凋亡。因此，调控ERS及其诱导的肝细胞凋亡已成为治疗NAFLD的新思路[2]。白藜芦醇(resveratrol，RVS)是一种天然的多酚类小分子化合物，广泛存在于红葡萄皮、虎杖、花生红衣和其他坚果中，具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡和调节糖、脂代谢等多种生理活性。人体实验表明，补充RSV对NAFLD患者具有积极的疗效，包括改善肝脏组织的胰岛素敏感性、调节肝脏的能量代谢水平和炎症反应[15]。体外细胞模型进一步发现，RVS能抑制花生四烯酸诱导的肝细胞凋亡[36]。动物试验也报道，RVS能通过抑制ERS来保护乙醇诱导的肝细胞凋亡[27]。然而，RVS能否通过调控ERS及其诱导的肝细胞凋亡来治疗NAFLD？

体育运动被认为是防治NAFLD最有效手段之一[25]。研究发现，运动训练能明显改善NAFLD大鼠肝脏病理学结构，并抑制肝细胞凋亡的发生[2,3]。然而，不同强度的耐力运动对NAFLD疗效是否存在差异？近年来，人们更热衷于将体育运动与RVS联合来探讨二者联用对衰老相关疾病的防治[29-30,39]，但目前二者联合干预是否对改善NAFLD脂质代谢、肝细胞凋亡具有协同或叠加效应仍不清楚？基于此，本研究通过观察不同强度运动训练和运动联合RVS干预对NAFLD大鼠脂代谢和肝细胞凋亡的影响，并从ERS角度揭示其对改善NAFLD的潜在机制，为临床上NAFLD的运动防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

将购于广州医学院动物中心的70只SD(sprague-dawley)雄性大鼠随机分为普通安静对照组(normal control，NC)和高脂饲料喂养组(high fat，HF)；再将HF组分为小强度耐力运动组(low intensity-endurance exercise，LE)、中等强度运动组(middle intensity-endurance exercise，ME)和递增强度运动组(incremental intensity-endurance exercise，IE)、RSV组和中等强度运动联合RVS组(RSV with middle intensity-endurance exercise，RE)，共计7组，每组10只。

1.2 非酒精性脂肪肝大鼠模型的构建

采用高脂饲料(在基础饲料基础上添加5%蔗糖、18%猪油、15%蛋黄粉、0.5%胆酸钠和1%胆固醇)喂养大鼠。喂养16周后，处死大鼠取肝组织制作HE切片，测试各项生理生化指标，并参考NAFLD病理诊断标准对本模型进行评估TG、TC、LDL-c、FFA及肝功能酶；同时制作肝组织病理HE切片，并送两位职业病理医师通过盲法诊断是否符合临床NAFLD患者诊断标准，建立NAFLD大鼠模型[16]。

1.3 运动方案

运动负荷的设定是根据大鼠的健康情况，参考Bedford TG经典跑台实验模型来设计。所有运动组大鼠在适应性跑台训练1周后进行相应强度运动，LE组：速度15 m/min，60 min/次/天；ME组：速度20 m/min，60 min/次/天；IE组：速度15 m/min(10 min)、速度20 m/min(30 min)，速度27 m/min(20 min)。所有运动组均5天/周，共6周。

1.4 给药方案

根据药理学给药原则，每天早上8:00给药，7天/周，共计6周。具体方法为：将RSV充分溶于双蒸水中，对RVS和RE这两组大鼠称重，并按照每只大鼠40.0 mg/kg/bw/天的剂量进行灌胃[1,18]。HF组大鼠给予同体积的双蒸水灌胃。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 血液指标测试

通过全自动生化分析仪检测血液中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)和游离脂肪酸(FFA)含量。

1.5.2 肝组织病理学切片

取部分肝脏用生理盐水漂洗数次后，将肝组织置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制备肝组织病理学切片。鉴于脂肪肝的病理切片在脱蜡过程中肝细胞中的脂肪沉积会被洗脱，故在光镜下呈空泡状，可用于鉴定NAFLD病理形态学特性。

1.5.3 肝脏组织免疫组织化学

将大鼠肝脏石蜡切片，按SASC法进行TUNEL和Bcl-2、Bax免疫组织化学染色，严格按照试剂盒说明进行规范操作。采用JVC3-CCD摄像头和Image-Pro Plus图像处理软件进行图像采集与分析。每只大鼠肝组织连续切片，每隔5张选取一张，共取8张切片，每张片随机选取6个视野，在400倍光镜下对7组大鼠肝脏内的凋亡细胞、Bcl-2和Bax的阳性表达计数。免疫组化定量分析结果以单个视野下阳性细胞光密度值表示。

1.5.4 蛋白免疫印记检测蛋白表达

每100 mg肝组织中加入1 mL的RIPA和10 μL 100 mM 的PMSF和10 μL的磷酸酶抑制剂。匀浆机匀浆后将含样品高速离心，将上清小心转移到干净无菌离心管中，置于-20℃冰箱保存。取肝组织裂解液，并加电泳上样缓冲液，电泳(5%浓缩胶90 V，12%分离胶110 V，不恒定电流)，约1.5 h，取分离胶进行转膜(90 V，90 min)，然后打开电转仪，取出硝酸纤维膜(NC)，去离子水洗涤，洗液平衡后用5%脱脂奶粉(TBS稀释)室温封闭30 min，再4℃过夜，加已稀释好的鼠抗兔抗GRP78、Caspase3、IRE1、p-IRE1、JNK1、CHOP、PERK、eIF2α(美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜，PBS洗膜，再加5 mL的1∶5 000稀释(稀释液含2%脱脂奶粉)羊抗兔二抗(北京博奥森)，37 ℃反应1 h，把NC上PBS吸干，加入ECL化学发光试剂，完全浸透后，放于胶片上，盖上保鲜膜，放入X射线暗盒，应用Quantity One凝胶电泳图像软件系统分析，以胶片中(蛋白条带中的灰度值/内参β-action灰度值)的比值大小表示。

1.6 数据分析

2 实验结果

2.1 各组大鼠血脂变化

表1结果显示，与HF组相比，其他各组TG非常显著性降低(P<0.01)；与LE组相比，ME组和IE组TG显著性降低(P<0.05)，与ME组相比，RE组TG显著性降低(P<0.05)，与RSV组相比，IE组和RE组大鼠TG非常显著性降低(P<0.01)；与HF组相比，NC组和RE组TC非常显著性降低(P<0.01)，其他组均显著性降低(P<0.05)；与HF组相比，NC组和RE组的LDL-c非常显著性降低(P<0.01)，LE组、ME组、IE组和RSV组大鼠LDL-c显著性降低(P<0.05)，与LE组相比，IE组LDL-c显著性降低(P<0.05)，与ME组相比，RE组LDL-c降低且有非常显著性差异(P<0.01)，与RSV组相比，RE组LDL-c非常显著性降低(P<0.01)；与HF组相比，其他各组FFA均非常显著性降低(P<0.01)，与LE组相比，ME组FFA显著性降低(P<0.05)，而RE组FFA也非常显著性降低(P<0.01)；与ME组相比，RSV组FFA显著性升高(P<0.05)，RE组FFA非常显著性降低(P<0.01)；但与RSV组相比，RE组FFA则非常显著性降低(P<0.01)。

2.2 各组大鼠HE染色肝组织病理学切片

图1B显示，HF组大鼠的肝小叶和肝索消失，肝细胞内可见脂肪小空泡，且散布胞浆中，脂肪融合大空泡的出现将细胞核挤压到细胞膜边缘，并融合成大小不一的脂囊。同时，伴有小叶内混合性炎症细胞的浸润。LE组大鼠肝小叶内可见弥漫性脂肪泡分布，脂肪大泡参杂其间，但脂肪变性程度明显下降，且肝小叶内炎症病灶减轻(图1C)；ME(图1D)和IE(图1E)组大鼠的肝组织尚可见弥散性脂肪小泡，单脂肪大泡明显减少，且炎性病灶明显减轻。RSV组大鼠肝小叶结构尚可见，肝细胞呈放射排列，形成肝细胞索，但肝小叶结构紊乱，肝细胞较NC组体积增加，胞浆疏松呈网状，肝细胞内、细胞核周围脂肪空泡较HF组体积减小，脂肪变性程度减轻(图1F)。值得指出的是，RE组大鼠肝小叶清晰，肝索可见，脂肪空泡数目明显减少(图1G)。

表1 各组大鼠血脂各项指标的变化

图1 本研究各组大鼠肝组织HE染色切片镜下示意图(400×)(A～G)

2.3 各组大鼠肝细胞凋亡变化

图2运用TUNEL法对肝细胞进行原位末端标记，观察肝细胞的凋亡情况。图2结果显示，NC组大鼠肝细胞凋亡细胞数目极少，细胞排列整齐(图2A)；HF组大鼠肝细胞呈现深褐色阳性染色，并在肝小叶内多为散在分布，凋亡的细胞呈圆形或椭圆形(图2B)；经6周不同强度运动和RVS单独或联合干预后发现，各运动组大鼠肝细胞整体排列，阳性细胞着色较HF组颜色相对较浅，LE(图2C)和IE(图2E)组的阳性细胞显著性降低(P<0.05)；而ME组阳性细胞数目呈现极显著性降低(P<0.01)(图2D)；RE组(图2G)大鼠的肝细胞核染色多呈蓝色，阳性细胞数量减少且着色较浅，阳性细胞的表达率不仅极显著性低于HF组(P<0.01，图2B)，甚至低于ME组(P<0.05，图2D)。2.4 各组大鼠肝细胞Bax和Bcl-2表达变化

Bcl-2和Bax蛋白主要在肝细胞胞浆内表达，阳性表达呈现棕黄色颗粒，阴性表达无着色。图3结果显示，NC组(图3a)Bax阳性表达最弱，其他各组Bax阳性表达升高；与HF组(图3b)相比，ME组(P<0.01，图3d)、RE组(P<0.01，图3g)和LE组(P<0.05，图3c)Bax阳性表达降低；其中，IE(图3e)组Bax表达显著高于ME组(图3d，P<0.05)，尽管RSV组(图3f)Bax表达高于ME(图3d)组，但无显著性差异(P>0.05)；此外，RE组(图3g)Bax阳性表达则显著低于ME组(P<0.05，图3d)。

从图3A中看出，NC组大鼠肝细胞胞浆内的Bcl-2表达量最高，HF组(图3B)显著性低于NC组(P<0.01，图3A)；与HF组(图3B)相比，各运动组(图3C-G)中Bcl-2阳性表达均呈现不同程度的增加，尽管LE组(图3C)和RSV组(图3F)的Bcl-2表达显著性增加(P<0.05)，但ME组(图3D)呈现极为显著性的差异(P<0.01)，RE组(图3G)也出现极为显著性的差异(P<0.01)；另外，较之ME组(图3D)，IE组(图3E)Bcl-2表达显著性地减少(P<0.05)，RE组(图3G)Bcl-2表达则显著性地增加(P<0.05)。

图2 TUNEL检测各组大鼠肝细胞凋亡率示意图

图3 各组大鼠肝组织内Bax(a-g)和Bcl-2(A-G)蛋白表达示意图

2.5 大鼠肝脏GRP78、Caspase3蛋白表达及GRP78/Caspase3比值变化

图4A～C结果显示，与HF组相比，NC组大鼠肝细胞GRP78和Caspase3的蛋白表达均显著性降低(P<0.01)；图4B显示，与HF组相比，LE组(P<0.01)、ME组(P<0.01)、IE组(P<0.05)、RE组(P<0.01)Caspase3蛋白表达显著降低；此外，IE组Caspase3蛋白表达显著高于ME组(P<0.05)，而RE组显著性低于ME组(P<0.05)；LE组、ME组和RE组均显著低于RSV组(P<0.05)。

图4C结果显示，与HF组相比，ME组和RE组GRP78/Caspase3比值显著性增加(P<0.01)；与ME组相比，RE组GRP78/Caspase3比值显著性增加(P<0.01)，与RSV组相比(P<0.01)，ME组和RE组GRP78/Caspase3比值均显著增加。

2.6 大鼠肝脏CHOP和JNK1蛋白表达的变化

图5A显示，与HF组相比，NC组(P<0.01)、LE组(P<0.05)、ME组(P<0.05)和RE组(P<0.01)CHOP蛋白表达均显著性降低；与ME组相比，RE组大鼠肝组织CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05)；与RSV组相比，RE组肝脏CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05)。

图5B显示，与HF组相比(P<0.05)，NC组(P<0.01)、LE组(P<0.05)、ME组(P<0.05)和RE组(P<0.05)JNK1蛋白表达显著降低(P<0.05)；与ME组相比，RE组大鼠肝脏的JNK1蛋白表达显著降低(P<0.05)，与RSV组相比，RE组大鼠肝脏JNK1蛋白表达显著降低(P<0.05)。

图4 各组大鼠肝组织GRP78(A)和Caspase3(B)蛋白表达及GRP78/Caspase3比值(C)变化示意图

图5 各组大鼠肝组织CHOP(A)和JNK1(B)蛋白表达示意图

2.7 各组大鼠肝脏IRE1、p-IRE1、PERK和eIF2α蛋白表达的变化

图6结果显示，与HF组相比(P<0.01)，NC组大鼠肝组织IRE1(图6A)、p-IRE1(图6B)、PERK(图6C)和eIF2α(图6D)蛋白表达显著降低，ME组和RE组p-IRE1(图6B)、PERK(图6C)和eIF2α(图6D)蛋白表达均显著性(P<0.05)降低；ME组IRE1(图6A)则显著性增加；与ME组相比(P<0.05)，RSV组大鼠肝脏组织IRE1(图6A)和PERK(图6A)蛋白表达显著降低，RE组eIF2α(图6D)蛋白表达显著减少(P<0.01)，RE组PERK(图6C)和IRE1(图6A)蛋白表达显著增加(P<0.05)；图6B显示，IE组和RSV组大鼠肝脏p-IRE1蛋白表达显著高于ME组(P<0.05)；与RSV组相比，RE组PERK蛋白表达显著性升高(P<0.05，图6C)，RE组eIF2α蛋白表达则显著性下降(图6D，P<0.01)。

图6 各组大鼠肝组织IRE1(A)、p-IRE1(B)、PERK(C)和eIF2α(D)蛋白表达示意图

3 讨论

3.1 NAFLD肝细胞凋亡与内质网应激

尽管对NAFLD的发病机制仍不清楚，但业界普遍认为“二次打击”(two-hit)学说在NAFLD发病过程中扮演重要角色[37]。“二次打击”学说认为，第1次打击源于肝脏内脂质代谢异常导致体内大量的脂质沉积；第2次打击表现为脂质沉积导致的脂毒性诱发肝细胞氧化应激损伤、炎症反应、线粒体能量代谢紊乱，引发肝细胞凋亡[13]。本研究表1表明，16周高脂饲料喂养可诱导大鼠机体脂肪代谢明显异常，表现为血液TG、TC、LDL-c和FFA等指标的显著高于对照组；HE肝组织学病理切片显示，肝脏的脂质大量沉积、肝小叶和肝索消失，肝细胞内、核周可见脂肪小空泡，散布在胞浆中，脂肪融合大空泡的出现，将细胞核挤压到细胞膜边缘，类似脂肪细胞，并融合成大小不一的脂囊。伴有小叶内混合性炎症细胞浸润(图1B)。赵军等[6]研究表明，16周高脂饮食诱导大鼠肝功能酶和血脂含量异常，肝脏呈现氧化应激损伤、脂肪肝炎和纤维化等特征。李军汉等[2]实验发现，8周高脂饮食能造成大鼠肝细胞脂肪变性明显，肝细胞排列紊乱，可见大量肝细胞空泡、气球样变，但未从NAFLD临床上常规的生理生化、病理学切片和盲法诊断等诊断标准进行复制动物模型。依据NAFLD生理生化和病理诊断标准和赵军[6]等研究，本研究认为，16周高脂饮食可成功复制NAFLD大鼠模型。而这与国外文献[16]报道的高脂饮食喂养大鼠16周后可以形成NAFLD大鼠的结论是一致的。

Arguello等[9]研究认为，脂肪大量堆积直接导致肝细胞线粒体功能失调、细胞氧化应激损伤，进而引发肝细胞凋亡。本研究图2结果证实，16周高脂饮食可诱导大鼠肝细胞凋亡率显著增加，这也得到李军汉等[2]实验的证实。李军汉等[2]研究发现，8周高脂饮食就可导致大鼠肝细胞凋亡率显著增加。然而，NAFLD大鼠肝细胞凋亡是否由线粒体凋亡途径所介导目前仍存在争议。M Rodrigues等[28]研究表明，NAFLD肝细胞凋亡与程序性细胞死亡因子4(pro-apoptotic target programmed cell death 4，PDCD4)激活有关。Zhen等[43]研究发现，PDCD4能激活Bcl-2介导的线粒体凋亡途径。作为Bcl-2家族成员，位于线粒体外膜的Bcl-2是凋亡抑制蛋白，可与胞浆中Bcl-2家族另一成员Bax(促凋亡因子)形成同源二聚体后向线粒体膜移动，进而利于线粒体膜电位的稳定，直接或间接地阻断细胞色素C释放及其下游Caspase-3凋亡信号级联的启动，起到抗凋亡作用。本研究图2结果显示，HF组(图3B)大鼠肝脏组织Bcl-2蛋白表达明显低于NC组(图3A)，同时HF组Bax(图3b)和Caspase-3(图4B)蛋白表达则显著高于NC组大鼠。提示，高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型的肝脏脂毒性导致了肝细胞凋亡信号级联激活，引发细胞凋亡(图2)。

ERS在NAFLD发病过程中扮演重要角色[38]。ERS主要由缺氧、氧化应激等刺激致使内质网内非折叠蛋白增多，导致内质网膜上感受器蛋白与GRP78分离，从而引发ERS。一方面，ERS可调节蛋白质合成途径并促进错误折叠蛋白降解过程，维持细胞内蛋白质稳态；另一方面，延迟或过度的ERS经GRP78、CHOP和Caspase3启动肝细胞线粒体凋亡途径[20]。Ozcan等[33,24]研究发现，肥胖大鼠肝脏ERS标记物表达较高，并与肝脏损伤标志物表达和脂肪肝患病率呈正相关。提示，NAFLD肝组织脂质沉积、肝细胞凋亡与ERS有关[24，40]。为了明确ERS与细胞凋亡的关联，本研究引入“ERS”强度概念[5]，即采用GRP78/Caspase3比值来评价肝细胞ERS启动未折叠蛋白反应后，是抵御外界干扰保护肝细胞功能，还是启动Caspase级联反应引起细胞凋亡。本研究图4显示，HF组大鼠肝组织GRP78和Caspase3蛋白表达均显著高于NC组，但GRP78/Caspase3比值显著低于NC组。结合图2和图3结果推测，高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝细胞ERS强度过度，后者经Caspase3和Bax途径启动了肝细胞凋亡过程。

作为ER腔中最丰富的分子伴侣，CHOP 和GRP78参与肝细胞凋亡，二者也被认为是介导ERS诱导肝细胞凋亡的标志性蛋白。研究表明，CHOP能调节凋亡因子表达，包括Bcl-2家族和Caspase3家族[10]。在无ERS状态下，GRP78与肌醇需要蛋白1(IRE1)和内质网RNA样蛋白激酶(PERK)结合而处于失活状态；但处于ERS过度状态时，GRP78与IRE1及PERK分离而活化，作为内质网Ⅰ型跨膜蛋白，IRE1活化将激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介导的凋亡途径[11,36]；PERK活化将经eIF2α上调CHOP表达。总之，ERS可以同时经IRE1/JNK通路和PERK/eIF2α/CHOP两条通路诱导肝细胞凋亡[10]。本研究图5B和图6结果显示，HF组大鼠肝组织IRE1、JNK、PERK、eIF2α和CHOP蛋白表达均高于NC组。提示，NAFLD大鼠肝细胞线粒体凋亡途径的启动与ERS诱导IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP两条通路同时活化有关。

3.2 内质网应激机制介导运动训练对NAFLD肝细胞凋亡的保护作用

流行病学调查显示[35]，久坐和缺乏活动与NAFLD的发生密切相关，体育运动是防治NAFLD最有效手段之一[25]。业已证实，体育运动改善机体的脂代谢与肌细胞对游离FFA的摄取及其分解供能增加有关。李军汉等[2]在高脂喂养过程中进行有氧运动干预发现，8周运动干预能预防高脂饮食导致的肝组织病理形态和肝细胞凋亡。然而，本研究对NAFLD大鼠进行运动干预，结果发现，所有NAFLD大鼠在运动干预后血清TG、TC、LDL-c、HDL-c和FFA均明显低于HF组(表1)。LE组(图1C)大鼠肝小叶内可见弥漫性脂肪泡分布，脂肪大泡参杂其间，但脂肪变性程度显著下降，小叶内炎症病灶减轻；ME(图1D)和IE(图1E)组大鼠肝组织尚可见弥散性脂肪小泡，脂肪大泡明显减少，炎性病灶明显减轻。研究证实，体育运动能减少NAFLD患者血液中TG、TC和FFA含量[32]。本研究图3和图4显示，所有运动干预组大鼠肝细胞凋亡、Bax及Caspase3蛋白表达较模型组明显升高，Bcl-2表达较模型组明显降低。结合本研究表1、图2和图3可推测，有氧运动训练可能通过改善NAFLD大鼠脂代谢，进而减弱了脂毒性所导致的肝细胞氧化应激损伤和肝细胞凋亡[19]。值得指出的是，本研究表1结果显示，ME组大鼠FFA水平显著低于RVS组。提示，运动训练对NAFLD大鼠的脂代谢改善优于RVS补充。这也得到Jeong等[21]研究印证。Jeong等[21]研究进一步表明，有氧运动对肥胖小鼠骨骼肌脂肪酸代谢相关基因表达、炎症反应的改善优于RVS组。总之，骨骼肌脂肪酸代谢基因表达和信号通路在中等强度耐力运动后的发生适应性改变参与了机体脂代谢改善过程。

本研究图4和图5A结果显示，与HF组相比，ME和LE组大鼠的CHOP、Caspase3、eIF2α蛋白表达和GRP78/Caspase3比值均显著降低；仅有ME组p-IRE1蛋白表达降低，而IRE1和PERK蛋白表达显著增加。提示，LE可能通过eIF2α/CHOP通路抑制NAFLD大鼠的肝细胞凋亡，而ME可能同时抑制了IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP两条通路，推测ME对NAFLD大鼠脂代谢和肝细胞凋亡的保护作用优于LE，这也得到了脂代谢相关指标TG、HDL-c、FFA(表1)和凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达的印证(图3)。罗艳蕊等[3]研究也证实，6周ME能明显改善NAFLD大鼠肝脏病理学结构，并抑制肝细胞凋亡发生。Kannan等[23]研究也认为，3种运动强度(小、中和大强度)中更建议采用中等强度运动，更有利于降低NAFLD患者血脂，同时在改善患者的心功能方面效果更好。

值得注意的是，IE组大鼠TG、TC、LDL-c和FFA显著低于HF组，但肝细胞IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP两条通路相关蛋白表达与NAFLD组均无显著性差异，仅Caspase3蛋白表达显著降低，这也说明IE对NAFLD脂代谢改善并非依赖IRE1/JNK和eIF2α/CHOP介导的凋亡通路调控；但可能依赖于脂联素对SIRT1/NF-KB介导的炎症通路抑制作用，后者减少了炎性细胞因子MCP1、NCF2基因表达，从而抑制NAFLD的炎症反应和纤维化程度，提高促进机体脂代谢水平[6]。

3.3 白藜芦醇对NAFLD肝细胞凋亡与内质网应激的影响

小分子多酚类物质RSV具有多种药理活性，可以发挥类胰岛素样作用，包括促进骨骼肌、脂肪、肝脏对葡萄糖和游离脂肪酸的摄取和利用，从而降低血糖、血脂水平[22]，RVS可用于NAFLD防治。人体研究表明，补充RSV可改善NAFLD患者的肝脏胰岛素敏感性、提高肝脏组织的能量代谢水平[12]。通过对NAFLD患者进行为期12周的RSV补充和单纯生活方式改变后发现，RSV补充对NAFLD患者肝脏组织的炎症反应的改善作用明显优于单纯生活方式[15]。研究表明，为期8周、剂量为8 mg/kg/天[41]、10 mg/kg/天[7]、15 mg/kg/天[18]、30 mg/kg/天[8]和40 mg/kg/天[18]的RSV补充可降低TG、TC和LDL-C，其中剂量10 mg/kg/天的RSV对TG和LDL-C改善分别达83%和86%。本研究表1结果显示，为期6周剂量为40 mg/kg/天的RVS对NAFLD大鼠血清TG、TC、LDL-c、HDL-c和FFA均具有改善作用。RSV组(见图1F)肝脏HE切片光镜下观察肝小叶结构尚可见。肝细胞呈放射排列，形成肝细胞索，但肝小叶结构紊乱，肝细胞较对照组体积增加，胞浆疏松呈网状，肝细胞内、细胞核周围脂肪空泡较模型组体积减小，脂肪变性程度减轻。曹姣等[2]研究也证实发现，剂量为40 mg/kg/天的RVS能通过降低TG、LDL-c和FFA来改善高脂饮食诱导的肥胖大鼠的脂代谢。尽管有研究认为RSV对NAFLD的改善仍存在争议[11]。推测可能与采用RVS剂量差异有关。

RVS对NAFLD患者的肝细胞凋亡是否具有保护作用尚不清楚。文献报道，花生四烯酸诱导肝细胞氧化应激可作为NAFLD体外细胞模型，RVS能抑制花生四烯酸诱导的肝细胞凋亡[36]。本研究实验证实，与NAFLD组相比，RVS降低NAFLD大鼠的肝细胞凋亡率、Bax及Caspase3蛋白表达，而Bcl-2表达显著增加。Liu等[27]研究也发现，RVS下调Bax蛋白表达，并降低Bax/Bcl-2比值和Caspase-3的活化，进而抑制乙醇诱导的肝细胞凋亡。Shin等[36]进一步发现，RVS可通过激活AMPK/GSK3beta来加强肝细胞抗氧化活性，进而保护花生四烯酸诱导的肝细胞凋亡。作为SIRT1的激活剂，RVS能通过激活SIRT1降低乙醇诱导肝细胞ERS相关蛋白(GRP78、p-IRE1α、p-eIF2α、p-PERK和CHOP)和凋亡促进因子(Bax、ATF4和caspase-3/12)表达，进而通过抑制ERS来防止乙醇诱导的肝细胞凋亡[27]。

然而，RVS是否能通过调节ERS来抑制高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝细胞凋亡？本研究结果表明，RVS对NAFLD大鼠肝细胞ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1、eIF2α、PERK和CHOP蛋白表达均没有明显影响(图4、图5和图6)。提示，单纯的RVS补充对NAFLD大鼠脂代谢的改善及其肝细胞凋亡的保护并非依赖于对ERS的调控。文献报道，RVS可通过激活AMPK[42]、TNF-alpha/NF-κB[8]和SIRT1[42]改善NAFLD大鼠脂代谢，这些信号通路是否与RVS抑制肝细胞凋亡有关有待进一步证实。

3.4 运动训练联合白藜芦醇对NAFLD肝细胞凋亡与内质网应激的影响

近年来人们热衷于将体育运动与RVS联合起来研究二者的协同效应[14,38,39]。文献表明，运动联合RVS对抑制机体炎症反应、提高细胞内抗氧化酶活性具有协同效应[17,31]，对改善心肌脂肪酸分解和骨骼肌运动能力优于单纯的耐力运动和RVS[17]。王军立等[4]研究发现，与单纯运动干预相比，运动联合RVS对2型糖尿病大鼠骨骼肌的胰岛素信号通路和脂代谢的改善作用更加显著。然而，运动联合RVS是否对NAFLD大鼠也有相似的保护作用？基于本研究发现的中等强度运动作用效果优于其他运动组，故在中等强度运动前补充剂量为40 mg/kg/天的RVS，探究RVS优化运动训练对NAFLD的保护作用。本研究表1显示，RE组大鼠血清TG、TC、LDL-c和FFA显著低于HF组，而HDL-c则明显高于HF组；值得指出的是，与ME组和RSV组相比，RE组大鼠TG、LDL-c和FFA显著降低(P<0.05)。RE(图1G)组大鼠肝小叶尚清楚，肝索可见，核周的脂肪小空泡数目明显减少。Dolinsky等[14]研究证实，与单纯的中等强度运动训练相比，运动训练联合RVS对肥胖大鼠的心肌细胞的脂肪酸分解速率、脂肪酸代谢相关基因及其信号通路的改善作用更为显著。提示，RVS补充可强化运动训练对肥胖大鼠脂肪酸代谢紊乱的调理作用。提示，运动训练联合RVS能更有效的改善NAFLD大鼠脂代谢紊乱，加速了脂代谢，降低血清FFA水平。

文献报道，RVS能强化运动训练对衰老大鼠的骨骼肌线粒体功能失调[30]、肝脏抗氧化酶活性降低[38]、系统性炎症反应的改善作用[29]。机制研究表明，SIRT1/FOXO3和PI3K/AKT双重信号通路介导了RVS对运动训练延缓心肌细胞衰老、抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡的强化作用[26]。

本研究图2和图3表明，RE组大鼠肝细胞凋亡和凋亡的相关蛋白表达明显低于ME组和RSV组，这说明运动干预联合RVS对NAFLD大鼠肝细胞凋亡的保护作用明显优于二者的单独作用。本研究图6进一步显示，ERS相关蛋白GRP78、IRE1、JNK1、eIF2α和CHOP在RE组的大鼠肝脏中的表达量显著低于ME组和RVS组。提示，运动联合RVS干预可能通过同时调控IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP双重信号通路来抑制NAFLD大鼠肝细胞凋亡信号级联的激活，从而更加有效的延缓NAFLD发展进程。

4 小结

1.16周高脂饮食可复制NAFLD大鼠模型，NAFLD大鼠肝细胞线粒体凋亡途径的启动与ERS诱导IRE1/JNK1通路和eIF2α/CHOP两条通路活化有关。

2.不同强度耐力运动对NAFLD大鼠血脂各项指标和肝细胞凋亡均有不同程度的改善作用，但中等强度耐力运动优于其他运动组，这可能依赖于对介导肝细胞内质网应激信号途径IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP调控。

3.白藜芦醇补充对NAFLD大鼠血脂各项指标和肝细胞凋亡也有改善作用，但并非依赖于对内质网应激介导的细胞凋亡途径的抑制。

4.白藜芦醇补充可以强化中等强度耐力运动对肝细胞内质网应激通路IRE1/JNK1和eIF2α/CHOP双重抑制效应，从而更加有效的改善NAFLD大鼠脂代谢和肝细胞凋亡。

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Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Exercise Training and Resveratrol-induced Prevention of NAFLD Rat Liver Cell Apoptosis

RUAN Ling1,LI Fang-hui2

Objective:To observe the impact on exercise and resveratrol (RSV) for blood lipids,liver cells apoptosis and endoplasmic reticulum stress on nonalcoholic fatty liver rats.Methods:70 SPF male SD rats were divided into seven groups,the normal control group (NC),high fat group (HF),model with low intensity-endurance exercise group (LE),model with middle intensity-endurance exercise group (ME),model with increment intensity-endurance exercise group (IE),RSV group,RSV with middle intensity exercise group (RE),10 rats in each group.rats were arranged to run on the treadmill 60 min per day and 5 days per week.Rats were given by gavage of resveratrol at the dose of 40mg/day,and 7 days a week.All the intervention lasted for 6 weeks.Blood lipids were determined,morphology of liver tissue was observed by making HE sections of liver tissue,the expression of Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemical method,and cells apoptosis was determined by TUNEL,the protein expression of GRP78,Caspase3,IRE1,p-IRE1,JNK1,PERK,eIF2α and CHOP were detected by Western-blot.Results:Compared to HF group,the content of TG,TC,FFA,LDL-c on NAFLD rats’ serum decreased.The expression of Bax decreased and cell apoptosis reduced.The expression of Bcl-2 and HDL-c increased.Compared to HF group,the protein expression of IRE1,PERK and the ratio of GRP78/Caspase3 increased.The protein expression of Caspase3,p-IRE1,eIF2α,JNK1 and CHOP decreased.The effect of ME group was better than LE group and IE group and RE group was the best in all groups.Conclusions:1) Duplicating the model of NAFLD after 16 weeks high-fat feeding,the enablement of mitochondrial apoptotic pathway of liver cells was related to the ERS induce the pathway of IRE1/JNK1 and the pathway eIF2α /CHOP on NAFLD rats.2)The different intensity of endurance exercise was improved blood lipids and liver cells apoptosis on NAFLD rats in different levels,but ME group was better than other exercise groups,this may depends on the regulation of liver cells mediated endoplasmic reticulum stress signaling pathways IRE1/JNK1 and eIF2α/CHOP.3) Resveratrol could improve apoptosis of liver cells on NAFLD rats,but not depends on regulation of ERS signaling pathway.4) RE group reminds that resveratrol can strengthen the control of endurance exercise to ERS signal pathway IRE1/JNK and elf-2α/CHOP,to improved lipid metabolism and apoptosis in liver cells of NAFLD rats more effective.

exercise;resveratrol;nonalcoholicfattyliverdisease;apoptosis;endoplasmicreticulumstress

1000-677X(2016)08-0056-11

10.16469/j.css.201608005

2016-01-19；

2016-07-25

国家自然科学基金青年科学基金项目(31500961)；广东省省级科技计划项目(2014A020220015，2015A020219015)；广东省高等学校青年创新人才项目(2014KQNCX225)；安康学院交叉融合项目(2015AYXKJC01)；安康学院高层次人才项目(2014AYQDZR02)。

阮凌(1983-)，女，陕西安康人，讲师，博士，主要研究方向为运动与慢性疾病的研究，E-mail:ruanling2000@qq.com；李方晖(1983-)，男，江苏连云港人，博士，在站博士后，主要研究方向为运动抗衰老机制研究，E-mail:249924208@QQ.com。

1.安康学院 体育学院，陕西 安康 725000；2.肇庆学院 体育与健康学院，广东 肇庆 526061 1.Ankang University,Ankang 725000,China；2.Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China.

G804.7

A