马占相思树皮中原花色素提取工艺及其生物活性的研究
2016-12-13张颖茵陆婷婷张萌卫
许 蕊, 姜 萍, 张颖茵, 陆婷婷, 李 根, 张萌卫
( 南京林业大学 化学工程学院, 江苏 南京 210037 )
·研究报告——生物质天然活性成分·
马占相思树皮中原花色素提取工艺及其生物活性的研究
许 蕊, 姜 萍*, 张颖茵, 陆婷婷, 李 根, 张萌卫
( 南京林业大学 化学工程学院, 江苏 南京 210037 )
通过正交试验优化了马占相思树皮中原花色素的3种提取方法的最佳提取工艺条件。结果显示,传统溶剂提取法的最佳工艺为:60 % 乙醇、70 ℃、70 min、料液比1∶18(g∶mL,下同),原花色素得率为7.42 %;微波辅助提取法的最佳工艺条件为:60 %乙醇、微波功率200 W、微波时间8 min、料液比1∶18,得率为7.05 %;超声波辅助提取法的最佳工艺为:70 %乙醇、超声波温度50 ℃、超声波时间50 min、料液比为1∶16,得率为8.57 %。超声波辅助提取法效果最好,浸提温度低,得率高。进一步对超声波提取物不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了研究。结果表明,乙酸乙酯萃取物对DPPH·清除效果最好,其半数抑制浓度(IC50)为17.94 mg/L ,低于对照样维生素C(Vc)的IC50值;乙酸乙酯萃取物对人肝癌细胞Bel-7404具有明显的抑制效果,IC50值为4.86 mg/L,与抗肿瘤药依托泊苷效果相当。
马占相思;原花色素;提取工艺;抗氧化;抗肿瘤
马占相思树(Acaciamangium) 属于豆科(Leguminoeae) 含羞草亚科金合欢属的常绿乔木,天然生长在澳大利亚、印度尼西亚等国家[1],我国引种马占相思主要分布在福建、广东、广西等亚热带地区。截止20世纪末,我国的马占相思树有近8万hm2,目前木材主要用于制浆造纸,树皮用于栲胶工业[2-3]。为了提高其利用价值,许多科研工作者对马占相思树皮的化学成分、生理活性及其机理做了多方面的研究[4-5],发现相思树种的次生代谢产物主要有生物碱、脂肪酸、萜类化合物、黄酮类化合物,其中含量最高的是多糖和复杂的酚类物质[6]。另外,通过MALDI-TOF MS和核磁共振对马占相思树皮中分离得到的缩合单宁低聚物进行分析,表明其主要由原花青定、原刺槐定和原翠雀定结构单元组成,且主要化学成分是原刺槐定[4,7-8],即马占相思树皮含有丰富的原花色素。而原花色素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、防治心脑血管疾病等生理活性,可应用于医药、食品、保健品及日用化学品等方面,具有广泛的应用前景[9-11]。马占相思树皮中植物多酚的提取工艺研究较多,但对其原花色素的提取研究很少[4,12-14]。本研究对马占相思树皮中原花色素的不同提取方法及提取工艺进行了比较与分析,同时对马占相思树皮中不同溶剂萃取物的抗氧化活性及体外抗肿瘤活性进行了初步研究,旨在为开发出一种天然的抗氧化剂和抗肿瘤药剂提供参考。
1 实 验
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料 马占相思(Acaciamangium)树皮(含水率9.38 %,粒径0.425 mm),由广西武鸣栲胶厂提供。原花色素A-2(PAC),Chroma公司;4 -(二甲胺基)肉桂醛(DMAC),Sigma-Aldrich公司;维生素C(Vc),安耐吉公司。胰蛋白酶消化液、四氮唑盐(MTT)、细胞培养基、人肝癌细胞Bel-7404、依托泊苷均由南京新药筛选中心提供。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器 UV-2450紫外可见分光光度计,日本SHIMADZU公司;AC5200DTD型超声波清洗机,南京安秀仪器设备有限公司;MAS-I型常压微波辅助合成/萃取反应仪,新仪微波化学科技有限公司;Molecular Devices M3酶标仪,美国桑尼维尔分子装置公司
1.2 提取方法
1.2.1 传统溶剂浸提法 准确称取已粉碎的马占相思树皮原料2.00 g,装入50 mL圆底烧瓶中,加入不同体积分数的乙醇溶剂,在不同的提取时间、提取温度和料液比(g∶mL,下同)条件下,进行加热提取(提取1次),过滤、定容至50 mL。测定原花色素的含量,并计算得率。
1.2.2 微波辅助提取法 准确称取已粉碎的原料2.00 g,装入50 mL长颈圆底烧瓶中,加入不同体积分数的乙醇溶剂,在不同的微波功率、辐射时间和料液比条件下,进行微波提取(提取1次),过滤、定容至50 mL。测定原花色素的含量,并计算得率。
1.2.3 超声波辅助提取法 准确称取已粉碎的原料2.00 g,装入50 mL离心管中,加入不同体积分数的乙醇溶剂,固定超声波功率200 W,在不同的提取时间、提取温度和料液比条件下,进行超声波辅助提取(提取1次),过滤、定容至50 mL。测定原花色素的含量,并计算得率。
1.3 原花色素的定量分析
1.3.1 标准曲线的绘制 根据文献[15~16]利用DMAC与PAC发生显色反应,在640 nm处测定其吸光度,对原花色素进行定量分析。先用酸化乙醇配置1g/L的DMAC溶液,并用铝箔保护,-20 ℃储存备用。再称取2.0 mg原花色素A-2于10 mL容量瓶中,用甲醇定容得到200 mg/L标准品溶液,以甲醇稀释至质量浓度为100、 50、 25、 12.5、 6.25和3.125 mg/L。分别向96孔板中加入63 μL不同浓度梯度的原花色素A-2标准品溶液,平行3份。用移液器吸取189 μL DMAC溶液于每一个孔中,并混合。将盘放入酶标仪中,在波长640 nm处测定其吸光度,得到原花色素A-2质量浓度(C,mg/L)与吸光度(A)的标准曲线:C= 0.005 94 + 0.001 39A,R2= 0.994。
1.3.2 样品中原花色素的测定 按照1.3.1节的方法测定样品对应的吸光度值,代入标准曲线计算得到原花色素质量浓度,按式(1)计算原花色素得率(Y)。
Y=CV/m×106×100%
(1)
式中:C―原花色素质量浓度,mg/L;V―待测提取液的总体积,mL;m―原料的质量,g。
1.4 不同溶剂萃取物的抗氧化活性
1.4.1 样品的制备 称取马占相思树皮粉末100.00 g于2 L圆底烧瓶中,加1 200 mL 95 %乙醇在50 ℃水浴中超声波辅助提取50 min,过滤,滤液减压浓缩除去乙醇,浓缩液用蒸馏水稀释,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,萃取液及萃余液(水样)再经减压浓缩、冷冻干燥后得到5种萃取物。每种萃取物再分别配成质量浓度为0.05、 0.10、 0.15、 0.30 、 0.45、 0.60 g/L的乙醇溶液,备用。
1.4.2 样品抗氧化活性的测定 以DPPH·清除率对样品抗氧化活性进行表征[17]。分别移取不同浓度的样品溶液各1.0 mL于10 mL离心管中,加入3.0 mL的0.08 mmol/L DPPH·乙醇溶液,反应30 min,在517 nm波长处测定吸光度。无水乙醇作为空白,每个样品平行3次。同时以维生素C作为抗氧化活性测定的对照组。按式(2)计算DPPH·清除率(抑制率)。
I= (A0- (As-Ac)) /A0×100%
(2)
式中:I―DPPH·清除率(抑制率),%;A0―1.0 mL无水乙醇+3.0 mL DPPH·溶液的吸光度;As―1.0 mL样品溶液+3.0 mL DPPH·溶液的吸光度;Ac―1.0 mL样品溶液+3.0 mL无水乙醇的吸光度。
1.5 不同溶剂萃取物抗肿瘤试验
1.5.1 样品的制备 按1.4.1节方法制备5种萃取物。以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂,分别配制成质量浓度为1、 10、 100、 1 000 mg/L的5种萃取物样品溶液。
1.5.2 抗肿瘤MTT方法实验 取指数生长期的人肝癌细胞Bel-7404,加入0.25 %胰蛋白酶消化液,消化使贴壁细胞脱落,计数2×104~4×104个/mL,制成细胞悬液。再取细胞悬液接种于96孔板上,每孔180L,置恒温CO2培养箱中培养24 h。换新的培养液,每孔加入20L萃取物样品,培养72 h。再在每孔中加入20L MTT试剂,培养箱中反应 4 h。吸出上清液,每孔加入150L DMSO,在平板摇床上振摇5 min。在波长为570 nm处,用酶标仪测定每孔的吸光度,并按式(3)计算细胞抑制率[16,18]。
y=(1-OD药敏组/OD空白组)× 100%
(3)
式中:y―细胞抑制率,%;OD药敏组―加入萃取物样品溶液的吸光度;OD空白组―不加样品溶液的吸光度。
以抗癌药物依托泊苷为标准对照物,比较半数抑制浓度(IC50)的大小,确定体外抗肿瘤活性的效果。每个样品平行实验3次。
2 结果与讨论
2.1 不同提取方法工艺条件优化及比较
2.1.1 传统溶剂提取法 在前期单因素试验基础上,选出乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、料液比(C)和提取温度(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验,以提取得到的原花色素得率为考察指标,优化提取工艺条件,结果见表1。
表 1 传统溶剂提取法正交试验设计及结果分析
由表1可知,各因素对提取得率影响的顺序为A>C>D>B,最优的试验方案为A2B2C2D1,即60 %乙醇为溶剂、提取时间为70 min、料液比为1∶18、提取温度为70 ℃。在此优化条件下进行了验证试验,测得原花色素得率为7.42 %。
2.1.2 微波辅助提取法 在前期单因素试验基础上,选出乙醇体积分数(A)、微波提取时间(B)、料液比(C)和微波功率(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验,以提取得到的原花色素得率为考察指标,优化提取工艺条件,结果见表2。
表 2 微波辅助提取法正交试验设计及结果分析
由表2可知,各因素对提取得率影响的顺序为A>C>D>B,最优的试验方案为A2B2C2D2,即60 %乙醇为溶剂、微波提取时间为8 min、料液比为1∶18、微波功率200 W。在此优化条件下进行了验证试验,测得原花色素得率为7.05 %。
2.1.3 超声波辅助提取法 在前期单因素试验基础上,选取乙醇体积分数(A)、超声波时间(B)、料液比(C)和提取温度(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验,以提取得到的原花色素得率为考察指标,优化提取工艺条件,结果见表3。
表 3 超声波辅助提取法正交试验设计及结果分析
由表3可知,各因素对提取得率影响的顺序为D>B>C>A,最优的试验方案为A2B2C2D3,即70 %乙醇为溶剂、提取温度50 ℃、料液比为1∶16、超声波时间为50 min。在此优化条件下进行了验证试验,测得原花色素得率为8.57 %。
2.1.4 3种提取方法比较 各称取马占相思树皮粉末2.00 g,分别采用微波辅助提取法、超声波辅助提取法、溶剂提取法优化后的最佳工艺条件进行提取,并用酶标仪测定原花色素得率,结果见表4。
表 4 3种提取方法提取工艺的比较
采用3种不同的提取方法并在最优的工艺条件下对马占相思树皮中的原花色素进行提取,由表4可知,微波辅助提取法和传统溶剂提取法对原花色素提取得率均小于超声波辅助提取法。超声波和微波辅助提取法相对于溶剂浸提法都有较大优势,微波辅助提取法具有提取时间短、节省能源等优点;而超声波辅助提取法具有提取温度低、提取得率高、可避免高温对活性成分的影响等优势。
2.2 不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性
采用超声波辅助提取法对马占相思树皮中原花色素进行提取,并依次用不同溶剂萃取,得到5种萃取物样品,用于测定体外抗氧化活性,测定结果如图1所示。由图1可知,随着样品溶液质量浓度增加,对DPPH·的清除率都逐渐增强。DPPH·清除率为50 %时,Vc对照样的半数抑制浓度(IC50)为54.24 mg/L,乙酸乙酯和正丁醇萃取液IC50分别为17.94和25.24 mg/L ,都低于Vc对照样(p<0.05),说明其具有很强的体外抗氧化活性。氯仿和水萃取液IC50分别为67.70和78.26 mg/L,有较好的体外抗氧化活性。因此,在相同质量浓度下,马占相思树皮提取物不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性中,乙酸乙酯萃取液最强,其次是正丁醇萃取液,石油醚萃取液最低。
2.3 不同溶剂萃取物的体外抗肿瘤活性
采用超声波辅助提取法对马占相思树皮进行提取,依次用不同溶剂萃取,得到5种萃取物样品,并对人肝癌细胞Bel-7404进行体外抗肿瘤活性实验,同时与依托泊苷标准样品进行活性比较,结果如图2所示。
由图2可知,不同的样品对人肝癌细胞Bel-7404的抑制率差别很大。抗肿瘤药依托泊苷和乙酸乙酯萃取物的IC50分别为3.18和4.86 mg/L,这表明乙酸乙酯萃取物对人肝癌细胞Bel-7404具有明显的抑制效果(p<0.05);氯仿、石油醚和正丁醇萃取物对人肝癌细胞Bel-7404的IC50分别为40.33、 71.29和189.32 mg/L,说明在较高的浓度下对人肝癌细胞Bel-7404有一定的抑制作用;而水萃取物对人肝癌细胞Bel-7404抑制活性较低。因此,乙酸乙酯萃取物具有较好的抗肿瘤活性。
图 1 马占相思树皮中不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性
图 2 马占相思树皮中不同溶剂萃取物的体外抗肿瘤活性
3 结 论
3.1 对比研究了从马占相思树皮中提取原花色素类化合物的3种提取方法,并通过正交优化得出3种不同提取方法的最佳工艺条件。传统溶剂提取法:以60 % 乙醇为溶剂,提取时间为70 min,料液比为1∶18,提取温度为70 ℃,原花色素得率为7.42 %;微波辅助提取法: 60 %乙醇为溶剂,微波时间为8 min,料液比为1∶18,微波功率200 W,提取得率7.05 %;超声波辅助提取法:以70 %乙醇为溶剂,超声波时间为50 min,料液比为1∶16,超声波温度50 ℃,提取得率为8.57 %。结果表明超声波辅助提取法效果最好。
3.2 对超声波辅助提取物不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了研究。结果表明,马占相思树皮不同溶剂萃取物对DPPH·清除都有一定效果,尤其是乙酸乙酯萃取物效果最好,半数抑制浓度(IC50)为17.94 mg/L,低于对照样Vc的IC50值,说明具有很强体外抗氧化活性,可作为一种天然的抗氧化剂。体外抗肿瘤活性研究结果表明乙酸乙酯萃取物对人肝癌细胞Bel-7404具有明显的抑制效果,IC50为4.86 mg/L,与抗肿瘤药依托泊苷效果相当。
[1]NEWAZ M S,MILLAT-E-MUSTATA M. Growth and yield prediction models forAcaciamangiumgrown in the plantations of the central region of Bangladesh[J]. New Forests,2004,27(1):81-88.
[2]陈丛瑾,胡华宇,覃宇奔. 马占相思树皮制取栲胶试验[J]. 广西科学院学报,2001,17(3):100-103.
[3]赵绍文,粱伟克,秦武明,等. 栲胶原料新品种—马占相思树皮利用研究[J]. 经济林研究,2001,19(4):38-40.
[4]ZHANG Liang-liang,CHEN Jia-hong,WANG Yong-mei,et al. Phenolic extracts fromAcaciamangiumbark and their antioxidant activities[J]. Molecules,2010,15(5):3567-3577.
[5]PIETARINEN S P,WILLFOR S M,SJOHOLM R E,et al. Extractives inAcaciamangiumandAcaciacrassicarpastemwood and knots[C]∥58th Appita Annual Conference and Exhibition Incorporating the Pan Pacific Conference:Canberra,Australia 19-21 April 2004 Proceedings,2004:557.
[6]SEIGLER D S. Phytochemistry ofAcacia-sensulato[J]. Biochemical Systematics and Ecology,2003,31(8):845-873.
[7]HOONG Y B,PIZZI A,TAHIR P M,et al. Characterization ofAcaciamangiumpolyflavonoid tannins by MALDI-TOF mass spectrometry and CP-MAS13C NMR[J]. European Polymer Journal,2010,46(6):1268-1277.
[8]HOONG Y B,PARIDAH M T,LOH Y F,et al. A new source of natural adhesive:Acaciamangiumbark extracts co-polymerized with phenol-formaldehyde (PF) for bonding Mempisang (Annonaceaespp.) veneers[J]. International Journal of Adhesion and Adhesives,2011,31(3):164-167.
[9]张慧文,张玉,马超美. 原花青素的研究进展[J]. 食品科学,2015,36(5):296-304.
[10]KRUGER M J,DAVIES N,MYBURGH K H,et al. Proanthocyanidins,anthocyanins and cardiovascular diseases[J]. Food Reaearch International,2014,59:41-52.
[11]CHEN B H,HUNG M H,CHEN J Y F,et al. Anti-allergic activity of grape seed extract (GSE) on RBL-2H3 mast cells[J]. Food Chemistry,2012,132(2):968-974.
[12]MAKINO R,OHARA S,HASHIDA K. Efficient extraction of polyphenolics from the bark of tropical tree species[J]. Journal of Tropical Forest Science,2009,21(1) 45-49.
[13]YANG Lei,SUN Xiao-wei,YANG Feng-jian,et al. Application of ionic liquids in the microwave-assisted extraction of proanthocyanidins fromLarixgmeliniBark [J]. International Journal of Molecular Science,2012,13(4):5163-5178.
[14]SUN Xiao-wei,JIN Zhi-min,YANG Lei,et al. Ultrasonic-assisted extraction of procyanidins using ionic liquid solution fromLarixgmeliniibark[J]. Journal of Chemistry,2013:1-9.
[15]WALLACE T,GIUSTI M. Evaluation of parameters that affect the 4-dimethylaminocinnam-aldehyde assay for flavanols and poanthocyanidins [J]. Journal of Food Science,2010,75(7):C619-C625.
[16]姜萍,刘鑫,萧伟,等. 巨尾桉叶中原花色素提取工艺比较及不同溶剂萃取物生物活性的研究[J]. 生物质化学工程,2015,49(4):19-24.
[17]韦献雅,殷丽琴,钟成,等. DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J]. 食品科学,2014,35(9):317-322.
[18]李上标,裴淑艳,蒋超,等. MTT比色法研究应用进展[J]. 西北民族大学学报:自然科学版,2013,34(3):68-73.
Extraction Technology of Proanthocyanidins from Acacia mangiumBark and Its Bioactivities
XU Rui, JIANG Ping, ZHANG Ying-yin, LU Ting-ting, LI Gen, ZHANG Meng-wei
(College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)
The optimum extraction conditions of three extraction methods of proanthocyanidins fromAcaciamangiumBark were investigated by using orthogonal experiment. The extracted results were compared.Then,the vitro antioxidant and anti-tumor activities of different solvent extracts from ultrasonic extracts were studied.The optimum crafts for traditional solvent extraction method were 60 % ethanol,70 ℃,70 min and ratio of material-liquid 1∶18 (g∶mL,the same below),and the obtained yield of proanthocyanidin was 7.42 %.The optimum crafts for microwave-assisted extraction were 60 % ethanol,8 min for microware time,ratio of material-liquid 1∶18,microwave power 200 W,with the yield of proanthocyanidin 7.05 %.And the optimum crafts for ultrasonic-assisted extraction method were 70 % ethanol,ultrasonic time 50 min,ratio of material-liquid 1∶16,extraction temperature 50 ℃,and the yield of proanthocyanidin was 8.57 %.Result of ultrasonic-assisted extraction was the best,due to the low extract temperature and high yield.The results of antioxidant test showed that the ethyl acetate extracts from ultrasonic-assisted extracts exhibited the highest antioxidant activity,as well as the inhibitory concentration 50 %(IC50) of DPPH· radical scavenging was 17.94 mg/L,and it was lower than that of vitamin C(Vc).Experimental results of antitumor activity of different solvent extracts showed that the ethyl acetate extract possessed highest antitumor activity for human hepatoma cell Bel-7404 with the IC50of 4.86 mg/L,which was similar to antitumor medicine etoposide.
Acaciamangium;proanthocyanidins;extraction technology;antioxidant;antitumor
2016-07-01
江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目(201610298101X);江苏高校品牌专业建设工程资助项目(无编号);江苏高校优势学科建设工程资助项目(无编号)
许 蕊(1996— ),女,江苏扬州人,本科生,从事天然产物化学与应用研究;E-mail:1290412543@qq.com
*通讯作者:姜 萍(1969— ),黑龙江伊春人,副教授,硕士生导师,主要从事天然产物化学与应用研究;E-mail:cq_cheng@hotmail.com。
10.3969/j.issn.1673-5854.2016.06.007
TQ35
A
1673-5854(2016)06-0043-06