苦杏仁苷对变应性哮喘小鼠气道炎症的影响

卫 昊 许 栋 姚东风 胡 宇 刘继平

陕西中医药大学(咸阳 712046)



苦杏仁苷对变应性哮喘小鼠气道炎症的影响

卫 昊 许 栋 姚东风 胡 宇 刘继平

陕西中医药大学(咸阳 712046)

目的: 探讨苦杏仁苷对变应性哮喘小鼠气道炎症的影响。方法：雌性BALB/c小鼠50只，随机分为5组：分别为空白对照组、模型制造组、给药高剂量组(20mg/kg)、给药低剂量组(10mg/kg)和地塞米松磷酸钠阳性对照组(2mg/kg)。除了对照组以外，于第1、8天将每组的动物，以每只腹腔和皮下都给药0.1ml的致敏液，第15～28天各组(除了对照组)注射2.5%的OVA雾化激发，并且根据小鼠的体重注射相对应剂量的药物。在经过一周的治疗时间以后，取肺泡灌洗液(BALF)做一个细胞分类计数实验和酶联免疫法(ELISA)测BALF中炎症因子(IL-4，INF-γ)，采取气道进行病例分析。结果：苦杏仁苷10mg/kg组及20mg/kg组肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、淋巴细胞数、中性粒细胞数均比模型组显著降低,嗜酸性粒细胞降低尤其显著，病理学检测结果显示，苦杏仁各剂量组气管黏膜下层嗜酸性细胞，淋巴细胞、巨噬细胞等炎细胞浸润都有减轻趋势，且能够显著减少肺泡灌洗液中IL-4的含量，提高INF-γ的含量。结论：10mg/kg和20mg/kg的苦杏仁苷均可对患病小鼠变应性气道炎症产生明显的抑制作用。

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，主要受环境因素和免疫因素等引起，目前被定性为多基因遗传性疾病，该病是由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞等)及细胞组分参与，其中最常见的变应性哮喘通常是由吸入和食入变应原而诱发的，其发病的关键因素是患者的特应性素质和由其所导致的气道对变应原的敏感性和反应性增高，而且会使气道缩窄及气道炎症[1]。而免疫失衡是目前哮喘机制研究的热点，其中Th1/Th2失衡是重要的机制。Th1细胞主要释放INF-γ，能抵抗过敏反应；Th2细胞主要释放IL-4，能促进过敏反应。苦杏仁为蔷薇科植物杏(Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.)、西伯利亚杏(Prunus sibirica L.)、东北杏[Prunus mandshurica (Maxim.) Koehne]或杏 Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子[2]。苦杏仁生品以及各种炮制品有效成分苦杏仁苷在体内分解的氢氰酸能抑制呼吸中枢而起到镇咳，平喘作用，使呼吸加深，咳嗽减轻，痰易咳出。本文主要通过小鼠模型探讨苦杏仁苷对具有病变的小鼠变应性气道炎症的影响。

1 材 料

1.1 试 药 苦杏仁苷(购自中国食品药品检定研究院，批号：A1194)地塞米松磷酸钠(天津药液股份有限责任公司，批号:102604)。鸡蛋清白蛋白(上海生物科技有限责任公司，批号:110909)；氢氧化铝凝胶(扬州市星斗药业有限责任公司，批号:100805)；嗜酸性粒细胞计数液(北京建成生物工程研究院，批号:20131214)；IL-4及INF-γ ELISA试剂盒(北京凯基生物有限责任公司,批号：20121024)。

1.2 动 物 SPF级BALB/c雌性小鼠50只，6～8周龄，体重18～22g。西安交通大学医学院动物实验中心提供，许可证号:0011740。饲养环境: 陕西中医药大学动物房温度维持在 18℃～25℃，相对湿度40%～70%，实验前适应性饲养3d。

1.3 仪 器 S-888F型超声波雾化器(中外合资南京道芬电子有限责任公司)；FAH04N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；LDZS-2自动平衡离心机(北京医用离心机厂)。

2 方 法

2.1 患病小鼠模型的建立及给药方式 将50只正常小鼠随机分为5组：分别为模型组、试药高剂量组(10mg/kg) 组、试药低剂量组(20mg/kg)组、空白对照组、阳性对照组，每组10只小鼠。除对照组外，每组动物于第1、8天，每只皮下给药0.1ml致敏液，并腹腔注射0.1 ml致敏液(0.2 ml致敏液含OVA 0.1 mg，氢氧化铝0.02 mg)，第15～28天 2.5%OVA溶液雾化激发，雾化20 min。把相同剂量放入生理盐水代替致敏液给药于对照组，并采用生理盐水雾化。13～29d雾化，灌胃给药时间于每次雾化前30 min。

2.2 肺泡灌洗液(BALF)细胞学研究 在手术台上放置已处理的动物，将胸腔打开，用细绳把左支气管肺门部结扎；将气管小心分离开来，在不破坏周围组织的情况下,在气管环状软骨下方剪一V型切口，将针头前端磨平的2.5ml注射器插入，并且固定，1.5 ml生理盐水以每次0.5ml分3次灌洗。取一滴液体滴入血细胞计数池当中，待其静置以后在显微镜下读取白细胞的总数。1 000 r/min室温下离心15 min，将上清液倾出，取沉淀涂片固定，染液染色，在镜下读取300个白细胞，计算各种白细胞数目，计算各类白细胞所占白细胞百分比。综合白细胞的总数和各类白细胞的百分比最终换算得到BALF中各类白细胞数。

2.3 气道病理学检查 取小鼠气道组织，一般制备病理切片，进行病理检测采用HE染色，巩固液选用4%中性甲醛溶液，

2.4 ELISA法 测定肺部洗液(BALF)中 IL-4及INF-γ含量 取小鼠测定肺部洗液适量，按照ELISA试剂盒说明书进行操作测定IL-4及INF-γ含量。

3 结 果

3.1 苦杏仁苷对患病小鼠支气管炎症细胞计数的影响 与对照组相比较，模型组各种致病细胞数有显著性差异(P<0.01)，中性粒细胞有统计学的差异(P<0.05)；而与模型组比较，与阳性对照组相比、苦杏仁苷组给药后白细胞总数显著减少(P<0.01)；阳性对照组中的淋巴细胞有显著性差异(P<0.01)，苦杏仁苷组有统计学差异(P<0.05)；阳性对照组中的中性粒细胞，较模型组显著减少(P<0.01)，其他各给药组给药后较模型组相比较无明显差异；单核细胞数，阳性对照组较模型组显著减少(P<0.01)；嗜酸性粒细胞，阳性对照组，苦杏仁苷给药后显著降低(P<0.01)，苦杏仁苷组有所降低(P<0.05)，结果见表1。

表1 苦杏仁苷对支气管肺泡灌洗液中白细胞总数以及各炎症细胞的影响

3.2 气道病理学检测 可见对照组黏膜上皮完好，未见显著的脱落、坏死，固有层及黏膜下层中没有看见充血、水肿及炎细胞浸润细胞，外膜可见完整的透明软骨支架。模型组可见气管黏膜下层中度炎细胞浸润，主要包括嗜酸性细胞，淋巴细胞、巨噬细胞及少量浆细胞。与模型组相比较，各个给药组的病变都有减轻趋势，尤其地塞米松磷酸钠阳性对照组、苦杏仁苷组减轻趋势均略优于对照组以及模型组,结果见图1。

3.3 苦杏仁苷对哮喘小鼠BALF 中B细胞生长因子及INF-γ含量的影响 与对照组相比较，模型组BALF 中B细胞生长因子含量显著上升(P<0.05)，INF-γ含量显著下降(P<0.05)；苦杏仁苷组及地塞米松磷酸钠组BALF 中B细胞生长因子含量显著下降(P<0.05)，INF-γ含量显著上升(P<0.05)，说明苦杏仁苷能调节Th1/Th2免疫失衡。结果见表2。

表2 BALF 中IL-4及INF-γ含量(n=10)

A：空白对照组；B：模型组；C：地塞米松组；D：苦杏仁苷(10mg/kg)；E：苦杏仁苷(20mg/kg)

4 讨 论

哮喘是由多种炎性细胞、细胞因子和炎性介质共同参与的慢性非特异性炎症疾病，慢性炎症导致气道的高反应性，是哮喘患者临床迁延难愈，反复发作的重要原因[3]。其关键的效应细胞是嗜酸性粒细胞和Th细胞[4]。炎症细胞(尤其是嗜酸性粒细胞)在气道的局部聚集、炎症介质和细胞因子的释放等是形成和维持气道炎症并进而引起组织损伤和气道功能障碍的主要原因。哮喘发病的重要原因是由于体内的Th1/Th2比例失衡[5]。IL-4 是重要的Th2 型细胞因子，在黏液分泌，细胞及浸润等过程起着重要的作用；INF-γ为Th1型细胞的特征性细胞因子，主要作用是抑制IgE 的合成和Th2型细胞因子的分化[6-7]。Th2型细胞效应增强，同时Th1型细胞效应减弱，尤其是IL-4/IFN-γ的比例与哮喘的进展密切相关，因而人们常以此比例来间接反映Th1/Th2的比例。因此，改变Th1和Th2细胞的免疫失衡状态，使免疫反应由Th2 型向Th1 型逆转，在治疗支气管哮喘患者中起着重要意义。 临床上采用治疗哮喘的药物主要是β2受体激动剂、抗胆碱药、茶碱类等。这些药物都是针对单一靶点进行治疗，所以亟待寻找更有效的药物。哮喘属中医学的“哮病”范畴，中医药是寻找有效药物的宝库，而且中医药具有多靶点、多作用的特点。很多中药已经报道具有抗哮喘的作用，杏仁是有效的止咳药物，苦杏仁苷是其中主要成分，本实验对苦杏仁的抗哮喘作用及其机制进行了研究。

本研究发现高剂量苦杏仁苷可依赖性地升高INF-γ水平，减少患病小鼠BALF 中IL-4水平，降低IL-4/INF-γ的比值，由这个数据可得到苦杏仁苷可调节Th1/Th2比例的平衡，从而达到抑制炎性介质的发出和聚集、减轻哮喘气道炎症的目的。近几年来，中草药用于治疗各种疾病已是越来越常见且有很大的疗效，苦杏仁常常被称作维生素B17，已成为中医上常用的祛痰止咳剂，常用来辅助治疗癌症。但是误服过量的苦杏仁可导致机体中毒，利用纯天然药物治疗各种疑难杂症已成为新型治疗疾病的一种趋势。

[1] 李勇军．珠贝定喘丸联合布地奈德治疗哮喘发作期52例[J]．陕西中医，2014，34(3)：310-311．

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京：中国医药科技出版社，2015，201．

[3] 王超红，张凤宇，郭文新，等．玉屏风滴丸联合福莫特罗布地奈德治疗哮喘持续期临床观察[J]．陕西中医，2015，36(9)：1126-1127．

[4] 徐 姗，苏梦琪，吕伟红，等．异丁斯特对支气管哮喘豚鼠Th2型细胞因子白介素4、白介素13及嗜酸粒细胞趋化因子的影响[J]．中华哮喘杂志(电子版)，2009，3(5)：346-350．

[5] 张慧平，李元霞，庞随军，等．婴幼儿哮喘53例外周血Leptin、Eotaxin、总IgE检测及其临床意义[J]．陕西医学杂志，2013，42(1)：99-101．

[6] David H B，Fred F，Bruce S B，et al．Advances in mechanisms of asthma，allergy and immunology in 2010[J]．J Allergy Clin Immunol，2011，127(3)：689-695．

[7] 吕志宇，李晓红，荣本兵，等.实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠外周血单个核分泌IL-4[J]．陕西医学杂志，2010,39(3)：295-297.

(收稿2016-08-10；修回2016-08-29)

哮喘 动物，实验 大鼠 @苦杏仁苷

R256.12

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.055