四君子汤总多糖对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响*
2016-12-12唐华羽李玉芝李长德解云川
唐华羽 李玉芝 李长德 解云川
黑龙江省佳木斯大学附属第一医院骨外三科(佳木斯154002)
四君子汤总多糖对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响*
唐华羽 李玉芝 李长德 解云川
黑龙江省佳木斯大学附属第一医院骨外三科(佳木斯154002)
目的：探讨四君子汤总多糖对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响。方法：100只健康小鼠分为4组，每组25只。脾虚造模。正常对照组与模型对照组每天生理盐水灌胃，低剂量给药组每天每公斤体重1g四君子汤多糖灌胃，高剂量给药组每天每公斤体重2g灌胃。分析四君子汤总多糖对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响。结果：低剂量给药组及高剂量给药组胸腺指数级派氏结显著高于造模对照组。肠道sIgA含量显著高于模型对照组；低剂量给药组T淋巴结比例显著高于模型对照组。造模对照组双歧杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌水平均高于正常对照组。结论：四君子汤多糖能够纠正肠道菌群失调，恢复脾虚小鼠的免疫功能，并且有剂量依赖性。
肠道细菌易位是指肠道细菌及其产物在一定的条件下从肠腔易位至肠系膜或者其他肠外脏器的过程，严重的患者可出现严重肝病、自发性细菌性腹膜炎、肝肾综合征、肝性脑病、肝肺综合征。多糖是四君子汤含的有效成分之一，四君子汤多糖能够通过激活肠道黏膜局部的免疫从而影响机体的免疫功能[1-2]。目前四君子汤总多糖对机体免疫功能的作用机制还不十分明确。四君子汤在中医上是治疗脾虚之症的经典方，在现代医药研究中，其具有调节胃肠功能的作用，也具有促进代谢、保护肝脏、改善微循环、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗应激反应等作用[3]。研究显示四君子汤总多糖是四君子汤总多糖具有很强的免疫活性，能够增强免疫功能[4]。研究显示四君子汤能够改善肠道菌群失调[5]。本研究分析四君子汤总多糖通过肠道菌群对小鼠免疫功能的影响。现将结果报道如下。
1 材 料
1.1 动 物 100只健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～22g。
1.2 试剂、仪器及药物 番泻叶用10倍水煮沸10min，60℃浓缩为100%水煎剂，4℃保存。氯化钠注射液，冰乙酸，伊红美蓝琼脂，乳酸杆菌选择性琼脂，双歧杆菌BS培养基，类杆菌-胆汁-七叶皂琼脂，革兰染液，芽孢染液。立式压力蒸汽灭菌器，电热恒温培养箱，厌氧培养袋，厌氧产气剂，涡旋仪，高速离心机，血细胞分析仪，流式细胞仪。
2 方 法
2.1 分组 100只小鼠分为4组，四君子汤高剂量组(高剂量组)，四君子汤低剂量组(低剂量组)，模型对照组，正常组对照组,每组25只。
2.2 脾虚造模 除了正常对照组25只小鼠外，其余75只小鼠脾虚造模。用生药浓度为1g/ml的番泻叶水煎液灌胃，剂量每10g体重0.15ml，隔日禁食。连续8d。
2.3 给药方法 高剂量组在连续8d后四君子汤多糖溶液每公斤体重2g灌胃，低剂量组每公斤体重1g灌胃。模型对照组及针刺对照组均等体积蒸馏水灌胃。连续8d。
2.4 肠道菌群计数 取小肠盲肠内容物0.1g，置入灭菌EP管内，加生理盐水0.9ml，200转/min涡旋，混匀，均质化标本稀释度10-1，取0.15ml，加无菌生理压水1.35ml，混匀，标本稀释度10-2，继续10倍稀释至10-8。取稀释液，涂布法接种，定量0.1ml。进行菌落计数，采用菌落单位/g(CFU/g)对数值表示。各种细菌培养条件：双歧杆菌培养基BS，厌氧培养48h；乳酸杆菌培养基乳酸杆菌选择性琼脂，厌氧培养48h；脆弱拟杆菌培养基BBE，厌氧培养48h；大肠杆菌培养基EMB，需要培养24h。
2.5 外周血白细胞比例测定 摘小鼠眼球取血，滴在EDTA.K2抗凝采血管中，混匀，检测白细胞比例。
2.6 测定淋巴结以及脾脏淋巴细胞增殖能力 无菌条件下取小鼠肠系膜脾脏、淋巴结，置于预冷PBS无论培养皿中，研磨，200目网筛过滤，收集细胞，制备单细胞悬液，冷PBS液洗涤2次，1200转/min离心10min。低渗法裂解脾细胞红细胞，计数，调节细胞浓度2×106个/ml。制备的淋巴细胞悬液接种在96孔板，每孔190μl，每样6个复孔，其中3个孔加ConA液10μl，3个孔加等量培养液，另设调零孔，只有培养液。37℃，5%的CO2恒温箱培养68h，加浓度为5mg/mlMTT液20μl，孵育4h。取出后显微镜下观察有紫色结晶，1200转/min离心10min，弃去上清，加DMSO150μl/孔，震板10min，溶解结晶。酶标仪在570nm处测吸光值，计算刺激指数。脏器指数计算方法为脏器质量(mg)/体重(g)×10。记录小肠段派氏结。
2.7 测定肠道sIgA含量 自幽门开始，取小鼠小肠段20cm，置于含PBS液培养皿中，纵向剖开，转至离心管，涡旋15s，3000转/min离心10min，收集上清，采用ELISA方法测定sIgA含量。
2.8 检测肠系膜淋巴结T、B淋巴细胞比例 肠系膜淋巴结置于含PBS液培养皿中，研磨，制备悬液，1000转/min离心，4℃下，离心10min，PBS液冲洗2次。每样取细胞悬液100μl置于流失管中，加抗体，混匀，避光孵育20min，各管加PBS液2ml冲洗2次，加PBS液500μl重悬，流式细胞仪检测T、B淋巴细胞比例。
2.9 统计学方法 采用SPSS11.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用F检验或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组胸腺指数及派氏结个数比较 模型对照组胸腺指数及派氏结较对照组显著下降，而低剂量给药组及高剂量给药组胸腺指数接近正常对照组，显著高于造模对照组，低剂量组派氏结也显著高于模型对照组，差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 各组胸腺指数及派氏结个数比较
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
3.2 外周血红细胞、血红蛋白、白细胞水平比较 模型对照组血红细胞、血红蛋白、白细胞水平均显著低于正常对照组(P<0.05)；高剂量给药组白细胞计数及血红蛋白水平显著高于模型对照组(P<0.05),见表2。
表2 外周血红细胞、血红蛋白、白细胞水平比较
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
3.3 四组淋巴结及脾脏细胞增殖能力 模型对照组淋巴结及脾脏细胞刺激指数均较正常对照组显著下降(P<0.05)；低剂量给药组和高剂量给药组淋巴结及脾脏细胞刺激指数均显著高于模型对照组(P<0.05)。
表3 四组淋巴结及脾脏细胞刺激指数
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
3.4 各组外周血白细胞比例 模型对照组中性细胞、单核细胞构成比显著高于正常对照组，淋巴细胞显著低于正常对照组(P<0.05)；低剂量给药组和高剂量给药组中性细胞、单核细胞构成比显著低于造模对照组，淋巴细胞显著高于模型对照组(P<0.05)。
表4 各组外周血白细胞比例(%)
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
3.5 各组淋巴结T、B淋巴细胞比例以及肠道sIgA含量 模型对照组肠道sIgA含量显著低于正常对照组，而低剂量给药组和高剂量给药组显著高于模型对照组；模型对照组T淋巴结比例显著低于正常对照组，B淋巴细胞比例显著高于正常对照组(P<0.05)；低剂量给药组T淋巴结比例显著高于模型对照组(P<0.05)。
表5 各组淋巴结T、B淋巴细胞比例以及肠道sIgA含量
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
3.6 各组肠道菌群比较 造模对照组双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌水平均高于正常对照组(P<0.05)；低剂量给药组乳酸杆菌水平低于模型对照组，高剂量给药组乳酸杆菌、大肠杆菌水平均显著低于模型对照组(P<0.05)。
表6 各组肠道菌群比较(logCFU/g)
注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05
4 讨 论
君子汤方剂组成主要为白术、人参、甘草、茯苓，四味药均含有大量多糖。现代药理研究显示，白术能够提高淋巴细胞转化率，促进细胞免疫功能。人参增强机体对非特异性刺激的能力，可改变机体的反应性，增强机体对有害刺激的反应能力，增强机体耐缺氧水平，增强机体免疫功能。甘草具有抗炎、抗过敏的作用，能够保护肠道粘膜。有研究显示，四君子汤能够对抗环磷酰胺诱导的免疫抑制作用，促进淋巴细胞增殖，提示四君子汤能够促进小鼠的细胞免疫及体液免疫功能[6]。白术性苦，温，茯苓性甘、淡，党参性甘、平，甘草性甘、平。党参与甘草属阳，白术与茯苓属阴。现代药理研究显示，白术能够提高淋巴细胞转化率，促进细胞免疫功能。人参增强机体对非特异性刺激的能力，可改变机体的反应性，增强机体对有害刺激的反应能力，刺激垂体-肾上腺皮质系统，增强机体免疫功能。甘草具有抗炎、抗过敏的作用，能够保护肠道粘膜。现代药理显示，四君子汤方剂具有抗自由基损伤，改善内分泌，调节代谢等作用。四君子汤能够促进小鼠的细胞免疫及体液免疫功能。肠道黏膜的免疫细胞在受到刺激后，发生活化，分泌细胞因子，分泌型IgA，淋巴细胞细胞毒作用，发挥肠黏膜的屏障防御作用。淋巴细胞活化后可迁移至免疫系统其他部分，介导胃肠道局部黏膜免疫系统导致的全身性免疫反应。免疫细胞表面细胞膜分为大多为糖或者糖基化合物，是免疫细胞与其他活性物质作用的配体，四君子汤多糖有可能通过这些配体分子而发挥作用。在四君子汤对机体的免疫调节过程中，肠道黏膜免疫系统可能发挥了重要的作用，通过肠道免疫细胞，提供信息传递，通过神经内分泌网络联系，调节全身的免疫系统。四君子汤对肠上皮细胞具有促进增殖的作用。
肠道黏膜的免疫细胞在受到刺激后，发生活化，分泌细胞因子，分泌型IgA，淋巴细胞细胞毒作用，那个人发挥肠黏膜的屏障防御作用。淋巴细胞活化后可迁移至免疫系统其他部分，介导胃肠道局部黏膜免疫系统导致的全身性免疫反应。免疫细胞表面细胞膜分为大多为糖或者糖基化合物，是免疫细胞与其他活性物质作用的配体，四君子汤多糖有可能通过这些配体分子而发挥作用。经腹腔注射给药，四君子汤多糖成分经肠道特异受体主动转运，或者被降解为特定片段，进入血液，调节免疫系统。在四君子汤对机体的免疫调节过程中，肠道黏膜免疫系统可能发挥了重要的作用，通过肠道免疫细胞，提供信息传递，通过神经内分泌网络联系，调节全身的免疫系统。四君子汤对肠上皮细胞具有促进增殖的作用[7]。
IgA由肠道相关淋巴组织以及固有层B细胞产生，以sIgA通过肠上皮细胞转运，在肠腔发挥抗感染等功能。sIgA识别肠道细菌，组织细菌穿过肠上皮而发生肠道细菌易位[8-9]。sIgA的产生具有T细胞依赖性与非T细胞依赖性两种。在这两种机制中GALT均发挥了重要作用。T细胞依赖途径主要在PPs生发中心，而非T细胞依赖途径主要在成熟孤立淋巴滤泡[10]。sIgA的产生需要共生菌存在。本次研究结果显示，脾虚造模小鼠sIgA水平显著下降，说明脾虚小鼠肠道粘膜免疫功能下降。而四君子汤总多糖能够提高脾虚造模小鼠sIgA水平，提示四君子汤多糖具有免疫调节的作用，并且其对白细胞计数具有显著的恢复作用，改善白细胞中中性细胞、淋巴细胞以及多核细胞的构成比。派氏结是小肠壁的淋巴组织，滤泡区主要由B淋巴细胞组成，滤泡旁区主要为T淋巴细胞组成[11]。派氏结是肠道粘膜免疫系统诱导部分，在肠道粘膜免疫应答中发挥重要的作用[12]。其数量减少，结构改变均影响免疫应答过程。在本次研究中，脾虚造模小鼠派氏结数量下降，并且体积减小。给予四君子总多糖的给药组，数量显著增加。肠系膜淋巴结以T淋巴细胞为主，是肠道粘膜免疫应答的重要效应部分。在本次研究中，脾虚造模小组肠系膜淋巴结T淋巴细胞水平下贱个，B淋巴细胞比例升高，说明脾虚造模小鼠存在肠道粘膜免疫功能紊乱。经四君子糖多糖灌胃，T细胞水平升高，B细胞水平下降。
综上所述，四君子汤多糖能够纠正肠道菌群失调，恢复脾虚小鼠的免疫功能，并且有剂量依赖性。
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(收稿2016-09-20；修回2016-10-17)
Effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice
Department of the Third Bone Surgery, First Affiliated Hospital of Jiamusi University(Jiamusi 154002)
Tang Huayu Li Yuzhi Li Changde et al
Objective:To discuss the effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice. Methods:100 healthy mice were divided into 4 groups, each of 25 cases. Mice of high dose group, low dose group and model control group were spleen deficiency modelled. Normal control group and model control group were filled with normal saline every day, and low dose group was filled with Sijunzi decoction 1g/kg, and the high dose group was filled with Sijunzi decoction 2g/kg. The effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice was analyzed. Results:Thymus index and the Peyer's patch of the low dose group and high dose group were higher than the model control group, and the difference was statistically significant. Intestinal sIgA content were higher than the model control group, and the difference was statistically significant. T lymphocyte ratio of the low dose group was higher than the model control group. Bacillus, bacillus, lactobacillus, escherichia coli, bacillus sp levels of the model control group were higher than the normal control group, and those of the high dose group were lower than the model control group. Conclusion: Sijunzi decoction can correct the intestinal flora imbalance, restore the immune function of spleen deficiency mice, and there is a dose dependent.
Castrointestinal tract Autoimmunity @ Sijunzi decoction
*黑龙江省卫生计生委科研课题(2014-237)
胃肠道 自身免疫 四君子汤
R
Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.054
