大连地区麻鸡呼吸道病多病原检测分析

李　巍，陈明非

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁　大连　116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁　大连　116037）

大连地区麻鸡呼吸道病多病原检测分析

李巍1,2，陈明非1,2

（1.辽宁省大连市动物疫病预防控制中心，辽宁大连116037；2.辽宁省大连市畜牧总站，辽宁大连116037）

大连地区麻鸡呼吸道病流行严重，在流行病学调查的基础上，对引起该类疾病的病原进行了实验室检测，排除了新城疫和禽流感的感染，ELISA检测结果表明麻鸡群败血型支原体感染率很高，从有呼吸道症状的麻鸡中分离到一株鸡葡萄球菌，一株大肠杆菌，动物试验表明，这株大肠杆菌能引起雏鸡明显的呼吸道症状，鸡葡萄球菌仅引起雏鸡局部损伤，但不能排除鸡葡萄球菌和败血型支原体协同作用引发麻鸡呼吸道病的可能。通过对检测结果的分析，讨论了麻鸡呼吸道病发生的原因，提出了防控建议。

麻鸡；呼吸道病；败血型支原体；鸡葡萄球菌；大肠杆菌

近年来，庄河大骨鸡被一种外貌酷似的外来鸡抢占了市场，这种鸡俗称“麻鸡”，实际上是一种人工培育的生长快速的麻羽肉鸡，4月龄体重可达5 kg左右。大连地区养殖的麻鸡基本是从河南、广州等地引进。流行病学调查显示，大连地区麻鸡呼吸道病发病率明显高于其他品种的鸡，有的养殖场甚至出现麻鸡一年四季呼吸道病不断，而同群饲养的其他品种的鸡却无明显呼吸道病出现。发生呼吸道病的麻鸡群为25～60日龄不等，发病率30%～70%，患病鸡采食量下降，增重变缓，治疗易反复，迁延不愈，死淘率可达5%～20%。鸡呼吸道病病因复杂，与环境因素、感染性因素，饲料营养、应激等有关，其中，感染性因素又包括细菌、病毒、支原体、霉菌等[1]。2015年4月，对大连普兰店市太平、杨树房、莲山三个乡镇发生呼吸道病的麻鸡进行病因探究，考虑到麻鸡呼吸道病发病率高、死亡率低、病程长的特点，首先通过采集咽喉/泄殖腔拭子进行新城疫、禽流感病毒核酸检测，结果为阴性，从而排除了非典型性新城疫、温和型禽流感的感染，通过血清学检测查明了麻鸡败血型支原体感染情况，根据细菌分离鉴定，取得两株致病菌。本次检测对今后麻鸡的引进检疫和呼吸道病防治都有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本分别采自普兰店市杨树房镇李家村某鸡场、太平镇太平乡某鸡场、莲山镇高家村某鸡场，总计采25～60日龄有明显呼吸道症状的麻鸡38只，同群麻鸡血清120份。

1.1.2试剂禽败血型支原体（MG）抗体ELISA检测试剂盒购自北京爱德士-元亨公司，批号：99-06729-B721；营养肉汤、血液琼脂基础、麦康凯培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；小牛血清购自大连市博励生物科技有限公司；脱纤绵羊血购自大连医科大学实验动物中心。

1.1.3主要仪器法国梅里埃公司ATB自动化微生物鉴定系统（含ATB细菌鉴定试剂条），瑞士TECAN Inf inite M200全波长酶标仪，日本三洋MCO-15AC二氧化碳培养箱，上海森信SHP-250生化培养箱。

1.1.4试验动物7日龄雏鸡由旅顺韩伟鸡场提供，饲养7 d无异常后用于试验。

1.2方法

1.2.1一般临床检查包括临床症状观察、剖检病变观察，组织抹片检查。剖检前先对病鸡采血，用于血清分离。剖检时无菌剪取病鸡喉头、气管、肺、肝、脾、肾等组织，用灭菌棉棒蘸取眶下窦、鼻窦、气囊分泌物。

1.2.2MG抗体检测按ELISA试剂盒说明书对158份血清进行禽败血型支原体（MG）抗体检测。

1.2.3细菌分离鉴定无菌操作将喉头、气管、肺、肝、脾、肾，眶下窦、鼻窦、气囊分泌物这些样品先接种血清肉汤，分别置于普通大气条件下和10%CO2条件下37℃增菌培养48 h。增菌培养物再分别转移接种营养琼脂、麦康凯琼脂、巧克力琼脂，其中，巧克力琼脂置于10%CO2、37℃条件下培养，其他置于普通大气、37℃条件下培养，对转移接种的培养物多次分离纯化获得的纯培养菌，纯培养菌接种绵羊血琼脂平板检验溶血现象。对纯培养菌革兰氏染色镜检，根据镜检结果选择ATB细菌鉴定试剂条进行生化鉴定。鉴定好的细菌接种斜面培养基培养24 h后，4℃保存备用。

1.2.4致病力试验将保存的菌株复壮培养24 h，挑取菌苔用生理盐水稀释成10个麦氏单位，换算成活菌数约为3.0×109CFU/mL，每只鸡滴鼻点眼接种0.2 mL，即接种活菌约6.0×108个。每日观察发病情况，剖检死雏，回收细菌，连续观察10 d，10 d后全部处死，回收细菌。

2　结果与分析

2.1临床症状病鸡有明显的呼噜声，有的伴有其他症状：流泪；流鼻液；眼部三角区肿胀。

2.2剖检变化病鸡普遍表现喉气管黏液增多，气囊混浊，有的伴有其他病变：鼻腔内鼻甲骨肿胀充血；眶下窦有淡黄色液体；鼻窦或气囊有干酪样分泌物；肝脏肿大瘀血。

2.3组织抹片检查抹片经吉姆萨染色镜检，有的样本可见到少量散在球菌，有的样本可见少量短杆状菌。

2.4M M G G抗体检测38只病鸡MG抗体检测阳性31只，阳性率为81.6%。3个鸡场MG抗体检测结果如表1。

2.5细菌分离鉴定

2.5.1分离培养特性血清肉汤培养48 h后变成均匀一致的混浊，管底有白色絮状沉淀物，经多次转移接种，分离纯化后得到两株细菌，分别命名为DLM1和DLM2。DLM1在普通营养琼脂上37℃培养18 h，形成圆形、表面光滑、边缘整齐、隆起、不透明、乳白色，直径1～1.5 mm小菌落，室温下放置72 h，菌落由乳白色变成金黄色；在绵羊血琼脂平板上37℃培养24 h形成细小、突起的圆形菌落，呈乳白色，菌落周围有透明溶血环；在巧克力琼脂上10%CO2、37℃条件下培养24 h，形成细小、扁平、圆形、不透明、灰白色菌落。DLM2在麦康凯琼脂上37℃培养18 h，形成表面光滑、圆形、隆起、边缘整齐、粉红色、直径1.5～2.5 mm菌落，在绵羊血琼脂平板上37℃培养24 h形成灰白色圆形突起的大菌落，菌落周围有暗褐色不完全溶血环。DLM1和DLM2在绵羊血琼脂平板上的形态及溶血现象见图1。

表1　MG抗体ELISA检测结果Table1　The ELISA detection results of antibodies to MG

图1　分离菌在绵羊血平板上的生长特征Fig1　The grow th characteristics of iso lated strains at Sheep Blood Agar

2.5.2理化鉴定DLM 1革兰氏染色镜检为G+呈葡萄状排列的球菌，选择ID32 STAPH（葡萄球菌）鉴定试剂条进行生化鉴定，鉴定结果为鸡葡萄球菌（Staphylococcus gal linarum），生化试验结果如表2；DLM2革兰氏染色镜检为G-短粗、两端钝圆、散在或两两呈直线排列的杆菌，选择ID32E（肠杆菌科和其它非苛养革兰氏阴性杆菌）鉴定试剂条进行生化鉴定，鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia col i），生化试验结果如表3。此株大肠杆菌赖氨酸脱羧酶（LDC）反应阴性，比照ID32E鉴定试剂条说明书，大肠埃希氏菌中赖氨酸脱羧酶反应阴性的菌株占29%。

2.6致病力试验将30只14日龄雏鸡分为3组，两组为攻毒组，一组为对照组。DLM1攻毒组鸡雏表现精神萎靡，肿眼，流鼻液，但无鸡雏死亡，10 d后剖检发现鼻窦、眶下窦有黄色分泌物，从分泌物中回收到DLM1细菌，从内脏中没有回收到细菌。DLM2攻毒组鸡雏出现了呼吸急促的症状，呆立或喜卧，从攻毒后第4日开始出现死亡，以后每日陆续死亡，到第10日共死亡6只，存活4只，剖检病死雏及存活处死雏，均有喉气管黏液增多，死亡雏喉头处有出血斑块，肺肿胀淤血，气囊混浊，病程长的雏鸡胸腔有黄色渗出液。从发病雏的呼吸道及心脏、肝脏中均回收到DML2细菌。

3　检测结果分析

3.1鸡败血型支原体（MG）是以咳嗽、流鼻液、气管啰音以及呼吸道炎症为特征的传染病[2]，MG感染广泛分布于世界各国，在我国感染率很高，邵国青用平板凝集试验检测来自全国20个省、市和21个地区的400份鸡血清，阳性率高达78%[3]。经调查，大连地区养殖的麻鸡引进前后都没有进行过支原体免疫。本次对有明显呼吸道症状的麻鸡的MG抗体检测，阳性率达到81.6%，三个麻鸡养殖场的MG抗体抽样检测平均阳性率为78.3%,两者差异不大，表明大连引进的麻鸡MG感染率很高，虽然MG不是引起麻鸡呼吸道病的唯一诱因，但感染MG的鸡群呼吸道病发病风险及严重程度大大升高。苏丽伟等报道肉鸡单独感染支原体常呈隐性经过，但有应激因素出现则诱发慢性呼吸道病，合并感染其他病原体时死亡加重[4]。潘树德等对沈阳地区鸡慢性呼吸道病的流行病学调查显示MG感染率高的鸡场都有慢性呼吸道病病史或正在发病中，而MG感染率很低的鸡场未见或仅见个别鸡发生呼吸道病[5]。因此，麻鸡呼吸道病的高发与反复发作是败血型支原体、细菌性因素和北方环境气候因素共同作用的结果。败血型支原体抗生素治疗效果不好，防控措施主要是加强饲养管理，做好卫生消毒工作，预防其他引起呼吸道损伤的传染病发生。种鸡群通过免疫能有效控制MG感染，阻止垂直传播，保护下一代[6]，因此控制麻鸡呼吸道病的首要措施是从做好MG免疫的种鸡场引鸡苗。

表2　DLM 1生化试验结果Table2　The biochem ical test results of DLM 1

表3　DLM 2生化试验结果Tab le3　The biochem ica l test resu lts of DLM 2

3.2鸡葡萄球菌病有皮肤型、败血型、关节炎型、肺型和眼型[2]，本次试验分离到的鸡葡萄球菌属于金黄色葡萄球菌，采用滴鼻、点眼的方式感染雏鸡，仅引起雏鸡肿眼，鼻窦、眶下窦积液，无死亡出现，无明显呼吸道症状。朱晓平报道鸡葡萄球菌感染后发病情况与感染途径有很大关系，经呼吸道感染症状较轻[7]。本次试验分离到葡萄球菌的麻鸡临床呼吸道症状明显，考虑到鸡葡萄球菌对免疫器官的发育和功能有一定的抑制和破坏作用[7]，而鸡感染败血型支原体后是否会发病与有无其他病原体混合感染有关[2]，因此，可以推测临床上败血型支原体与葡萄球菌协同作用诱发了麻鸡呼吸道病。

3.3引起鸡呼吸道病的细菌有沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌等[8]，陈宝利、杨国良等从患呼吸道疾病的鸡群中分离到了副鸡嗜血杆菌[9-10]，证实了我国鸡群中存在副鸡嗜血杆菌。本次试验针对多种呼吸道致病菌进行分离，结果分离到一株禽大肠杆菌。禽大肠杆菌有多种血清型，表现形式复杂，引起呼吸道病的主要指气囊炎型和肺型[2]。贺常亮报道大肠杆菌侵入机体的途径主要是通过鸡上呼吸道感染[11]，本次试验从麻鸡分离到一株赖氨酸脱羧酶反应阴性的大肠杆菌，采用滴鼻点眼的方式接种雏鸡，能引发雏鸡呼吸道损伤，引起呼吸道病，证明禽大肠杆菌是麻鸡呼吸道病的重要病原之一。禽致病性大肠杆菌血清型众多，致病机理复杂，定植不同组织部位并引起不同病症的禽致病性大肠杆菌与其基因组多样性有关[12]，对引起麻鸡呼吸道病的大肠杆菌的血清型和基因进化情况还需要作进一步的探究。

[1]闫伟.鸡呼吸道疾病发生的原因及防治措施[J].畜牧与饲料科学，2011（11）：130.

[2]卡尔尼克主编.高福等译.禽病学(第10版)[M].北京：北京农业大学出版社，1999.

[3]邵国青.家禽支原体的防控现状及研究新进展[J].中国家禽，2009（11）：10-15.

[4]苏丽伟，李大竣，陈文山.肉鸡慢性呼吸道疾病的调查[J].中国畜牧兽医文摘，2013，29（1）：153-173.

[5]潘树德，李学俭，沈国顺，等.沈阳地区鸡慢性呼吸道病的流行病学调查[J].沈阳农业大学学报，2003-12，34（6）：446-447.

[6]李彦凤.种鸡败血性霉形体的控制[J].中国畜禽种业，2015（7）：142.

[7]朱晓平.鸡葡萄球菌病发病机理的研究[J].畜牧兽医学报，1990，21（2）：167-173.

[8]邢兰君.鸡呼吸道病的综合防控[J].中兽医学杂志，2012（1）：43-46.

[9]陈宝利，郭伶.鸡传染性鼻炎的血清型调查及鉴定[J].中国畜牧兽医，2007，34（1）：106-107.

[10]杨国良，郑杰，张发明，等.A型副鸡嗜血杆菌(山东株)的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：189-192.

[11]贺常亮.治疗鸡大肠杆菌病的中药方剂筛选及其作用机理研究[D].长春：吉林大学，2011.

[12]马兴树，范翠蝶，夏玉龙.禽致病性大肠杆菌研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：169-173.

Pathogens Detection and Analysis of Dalian Ma Chicken Respiratory Disease

Li Wei1,2,Chen Mingfei1,2
(1.DaLian Center forAnimal Disease Prevention and Control,LiaoningDalian116037; 2.DaLian Animal Husbandry Station,LiaoningDalian116037)

Dal ian Ma Chicken prevalence of respiratory disease was seriously.Laboratory detection on the infective pathogens was car ried out on the base of epidemiological investigation.Infection of Newcast le Disease Vius or Avian Inf luenza Virus was el iminated.The ELISA detection resul ts showed that Dal ian Ma Chicken were highly infected by Mycoplasma pneumoniae.One Staphylococcus gal linarum and one Escherichia col i were isolated f rom Ma Chicken suf fering f rom respiratory disease.Zoopery showed that the Escherichia col i could cause chicks obvious respiratory symptoms, the Staphylococcus gal l inarum caused local damage only.However,it couldn’t be ruled out that Ma Chicken respiratory disease were caused by synergistic action of Staphylococcus gal l inarum and Mycoplasma pneumoniae.The causes of Ma Chicken respiratory disease were discussed and proposals for cont rol measures were put forward though analysing the laboratory detection resul ts.

Ma Chicken;Respiratory disease;Mycoplasma pneumoniae;Staphylococcus gal l inarum; Escherichia coli

S858.28

B

1672-9692(2016)02-0031-05

2016-01-02

李巍（1981-），男，兽医师，大学本科，学士，研究方向为动物疫病防控及实验室检测。