胚胎期大鼠性腺生长与分化的研究

许丽惠 黄景星 王全溪

福建农林大学动物科学学院福州350002

胚胎期大鼠性腺生长与分化的研究

许丽惠 黄景星 王全溪*

福建农林大学动物科学学院福州350002

本试验旨在研究胚胎期大鼠性腺生长与分化的情况。选取12.5～15.5 dpc SD大鼠胚胎为研究对象，运用PCR技术进行大鼠胚胎性别鉴定，采用H-E技术对大鼠性腺分化形态进行观察。结果表明：12.5 d的鼠胚肾管已经开始形成，生殖嵴已经建立，此时仍无明显的性别分化形态；13.5 d的鼠胚开始出现性别分化的迹象，雄性的原始性索开始形成，雌性性腺分化比雄性稍晚，此期仍不易辨别出典型的卵巢特征结构；14.5 d的鼠胚性腺形态初步成型，此期性别明显分化，雄性的原始性索开始分化为实心原始生精小管，雌性胚胎中性腺分为两层，初步形成卵巢特征；15.5 d的鼠胚，雄性胚胎性腺中已经具有明显的曲精小管的雏形，雌性胚胎卵巢特征也开始明显。大鼠胚胎性腺从13.5 d胚龄时开始分化，15.5 d胚龄性腺特征明显。

大鼠胚胎原始生殖细胞性别鉴定性腺分化

性腺分化是指尚无雌雄之分的性腺向雌性或雄性性腺分化形成的过程。所有有性生殖的物种都来源于生殖细胞分化所形成的配子，生殖细胞是通过遗传物质传递得以繁衍。原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的前体细胞，不同物种PGCs的起源各不相同，成分也有所差异。人、哺乳动物及一些爬行动物的PGCs顺着背部间充质迁移到生殖嵴中继续分化发育。在某一特定时期，生殖嵴中的原始生殖细胞会开始向精原细胞或卵母细胞进行分化。生殖细胞在刚刚决定时不论形态还是行为在雄雌两性之间没有差别，一般在进入生殖嵴以后才开始出现性别分化。由初始形成的生殖腺分化为卵巢或睾丸，在性腺分化的基础上，继而进行了性别分化，发育成雄性或雌性[1]。性腺分化的深入研究对于胚胎发育研究具有重要意义。

目前很多学者对胚胎性腺分化做了研究。根据Clinton等[2]、Smith等[3]的研究资料，鸡胚在孵化的第22期（3.5 d）性腺由体腔上皮增厚形成皮质，外胚层的原始生殖细胞PGCs通过血液循环进入早期性腺。在第22～28期（3.5～5.5 d）期间某一时间点，性腺开始分化，发育出现差异。第30期（6.5 d）性腺在形态学上开始呈现差别。张颖等研究出施氏鲟的PGCs最早出现在1.5胚龄（days post-hatching，dph），并在10 dph时期形成性腺，性腺发育到180 dph时开始向卵巢或睾丸分化[4-5]。据黄美玉的研究表明，猪的胚胎发育到29 d时，生殖嵴中充满原始生殖细胞，30 d时性腺便开始分化，此时可观察到睾丸或卵巢具有的特征[6]。乔淑芬等认为，中国林蛙性腺分化开始于第31期，生殖腺向两性开始分化时首先形成的是初级卵母细胞和初级精母细胞[7-8]。杜启艳等发现泥鳅性腺发生于出膜后12 d，40日龄卵巢开始分

化，至55日龄卵巢分化完全，精巢于出膜后55 d左右开始分化，100 d左右分化完全，卵巢分化早于精巢[9-10]。

可见，各类动物性腺分化的时间都有所差异，分化过程也大相径庭，有的动物在性腺分化过程中在同一时期向着卵巢或睾丸进行分化，而有的动物卵巢与睾丸的分化时间却是错开的。大鼠作为常用的试验模型动物，目前对其胚胎性腺生长分化研究较少。本研究以大鼠胚胎为材料，运用PCR技术进行大鼠胚胎性别鉴定，然后对大鼠胚胎性腺分化的特点进行HE染色观察，为进一步研究大鼠胚胎发育、生殖细胞基因表达以及大鼠的繁殖性别控制等提供数据支撑。

1 材料

试验动物：健康3月龄SD大鼠6只，雌雄各半。自由采食和饮水。雄性大鼠确认其繁殖性能良好，雌鼠与雄鼠按1：1的比例合笼。次日早晨，检查阴栓。见阴栓日中午记为0.5 dpc(days post coition,交配后天数)。分别于12.5 dpc、13.5 dpc、14.5 dpc、15.5 dpc以剖腹产方法取大鼠胚胎，将其置于PBS缓冲液中备用。

胚胎的处理：每个胚胎取其头部组织进行DNA提取和PCR鉴定胚胎性别。头部以下胚胎组织用4%多聚甲醛固定液固定，用于HE观察。

2 方法

2.1 性别鉴定

2.1.1 引物设计SRY基因为Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。根据雄性大鼠的SRY基因（PubMed Nucleotide AF274872）设计一对特异性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，目的片段长度为510 bp。

上游引物：5'-ATGTCAAGCGCCCCATGAA-3'；下游引物：5'-TTAGCTGCTGCTAGTGGAACT-3'。

2.1.2 DNA的提取取胚胎头部组织，无菌获取组织悬液，按照DNA提取试剂盒说明书提取组织DNA。

2.1.3 PCR鉴定反应体系：DNA Sample（female and male）1.0 μL，2×Tap PCR MasterMix 12.5 μL，sense and antisense each 1 μL，加ddH2O至25 μL。

反应条件：94℃、2 min 30 s；→59℃、1 min；→72℃、1 min；→94℃、1 min，59℃、50 s，72℃、1 min，35个循环→72℃、5 min；→4℃。将PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

2.2 HE法对大鼠胚胎性腺分化形态观察将固定好的大鼠胚胎经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片制作及染色观察。观察12.5 d至15.5 d胚胎生殖嵴的组织形态学变化以及性腺分化特征，并用LEICA280显微摄像系统拍照。

2 结果

2.1 大鼠胚胎性别的PCR鉴定结果本次试验取12.5 d、13.5 d、14.5 d、15.5 d共四个时期大鼠胚胎进行性别鉴定。根据图1可知，PCR扩增产物大小与预期的一致，没有非特异性杂，阳性条带为雄性胚鼠，其余为雌性胚鼠。

2.2 HE法观察不同胚龄大鼠性腺组织结构通过HE染色观察大鼠胚胎组织形态结构可知，12.5 d的胚胎（图2 A、B）肾管已经开始形成，生殖嵴已经建立，且其中可见迁移来的原始生殖细胞；原始生殖细胞体积大，核大且呈圆形或卵圆形，此时仍无明显的性别分化形态，因此，此时大鼠胚胎未分化性腺。13.5 d的胚胎（图2 C、D）雄性的原始性索开始形成，生殖细胞向精子发生，细胞分化还不完全，但可见支持细胞呈梭形；雌性性腺分化比雄性稍晚，但仍不易辨别出典型的卵巢特征结构，因此，此时大鼠胚

胎开始出现性别分化。14.5 d的胚胎（图2 E、F）性腺与中肾开始分离，原始性腺开始膨大，性腺形态初步成型。随着性腺分化，性腺中的PGCs会逐渐分化成精原细胞和卵原细胞。雄性胚胎的原始性索开始分化为实心原始生精小管；雌性胚胎中性腺分为两层，外层含有生殖细胞，内层含有血管，具有卵巢特征，可见此时大鼠胚胎性别开始分化。15.5 d的的胚胎（图2 H、K），雄性胚胎的性腺中已经具有曲精细管的雏形，并可观察到支持细胞和精原细胞；母鼠胚胎卵巢特征也开始明显，外侧分布着大的生殖细胞，内侧含有血管和网状的细胞，因此，此时大鼠胚胎性别特征明显。

3 讨论

PGCs来源于胚外内胚层或上胚层，多数观点认为PGCs来源于上胚层[11]。小鼠PGCs最早出现于7.0～7.5 dpc，PGCs定位于后肠，从8.5 dpc开始迁徙，经背肠系膜迁徙至中肾侧的生殖嵴[12]。9.5 dpc，PGCs离开后肠，通过背肠系膜向靶器官生殖嵴迁徙；12.5 dpc，所有PGCs到达生殖嵴。在此迁徙中，PGCs数目增殖300倍，分裂周期为16 h。12.5 dpc，雄性生殖细胞呈索状排列，雌性则随意排列。13.5 dpc，雄性生殖细胞进入有丝分裂休止期，而雌性则开始减数分裂形成卵原细胞，后休止于减数分裂前期Ⅰ。出生后性成熟时，雄性生殖细胞恢复有丝分裂，形成生精干细胞，进一步减数分裂成精子；卵原细胞恢复减数分裂，产生成熟卵子[13]。

根据王美之等[14]的研究，小鼠胚胎在12.0 dpc时，生殖嵴开始增厚变大，PGCs明显增多，表面上皮向深部增殖，此时生殖嵴里没有出现明显的性别分化。12.5 dpc的小鼠胚胎，生殖嵴与中肾嵴之间纵沟明显，生殖嵴与中肾嵴明显分开，此时性腺已经开始性别分化，雄性逐渐形成条形性索，且原始性索有分化为原始生精小管的趋势，PGCs在生殖嵴中分布较均匀，而雌性生殖嵴生成皮质索。13.0 dpc的小鼠胚胎，雄性原始性索已经分化成实心的原始生精小管，雌性皮质索逐渐分离成许多孤立细胞团，由原始生殖细胞与周围上皮细胞组成。13.5 dpc小鼠胚胎，雄性原始生精小管明显可见，管腔中可见原始生殖细胞分化的精原细胞以及许多未成熟的支持细胞；雌性生殖腺中孤立细胞团逐渐发育成原始卵泡，原始生殖细胞分化为卵原细胞，周围有一层由上皮细胞分化而来的卵泡细胞。

本试验中，大鼠胚胎性腺在12.5 dpc前还未具有明显的睾丸和卵巢的特征，仍处于未分化时期。13.5 dpc开始出现性别分化的迹象，雄性的原始性索开始形成，生殖细胞向精子发生，支持细胞分化还不完全；此期仍不易辨别出典型的卵巢特征结构。14.5 dpc的大鼠胚胎性腺开始出现明显分化，此时的睾丸发育明显，原始性索开始分化为实心原始生精小管；雌性胚胎中性腺分为两层，外层含有生殖细胞，内层含有血管，即具有卵巢特征。15.5 dpc大鼠胚胎已明显出现精原细胞雏形和原始卵泡，其中公鼠胚胎精原细胞位于曲精细管管壁上，母鼠胚胎的原始卵泡出现在皮质层。可见，不同动物由于胚胎发育的时间不同，其性腺分化时间也表现不尽一致。因此，本研究可为大鼠胚胎发育的深入研究提供参考。在大鼠胚胎发育过程中，胚胎生殖嵴于11.0 dpc时已经生成。在本试验中，12.5 dpc大鼠胚胎已可见典型的生殖嵴形态；13.5 dpc生殖嵴开始有分化迹象，雄性大鼠胚胎开始形成原始性索，雌性表现不明显，即卵巢发育晚于睾丸；14.5 dpc则开始出现明显的分化特征。14.5 dpc至15.5 dpc之间，雄性与雌性原始生殖细胞发育具有显著差异并完成性别分化。这一结论为更进一步研究大鼠胚胎发育、生殖细胞基因表达等提供了理论依据，对于大鼠胚胎原始生殖细胞详细的形态学特征还需进一步研究。

4 结论

大鼠胚胎在13.5 dpc时生殖嵴开始有分化迹象，雄性大鼠胚胎开始形成原始性索，而雌性大鼠卵

巢发育晚于睾丸，在14.5 dpc时才开始出现明显的分化特征。这一结果为进一步研究大鼠胚胎发育、生殖细胞基因表达以及大鼠的繁殖性别控制等提供数据支撑。

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The study of the growth and differentiation of embryonic rat gonads

Xu Lihui Huang Jingxing Wang Quanxi*
（College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002）

The experiment was to study the growth and differentiation of rat embryonic gonads.In this experiment,six nest of 12.5～15.5 dpc embryos of SD rats,were selected and the sex was identified by PCR technology.Observation of gonadal differentiation characteristics was conducted on three male rats and three female rats of each embryo ages by using H-E techniques.On the 12.5 days' embryo,the renal tubular and genital ridge began to form,but still no clear sex differentiation morphology was observed in the rat embryos.On the 13.5 days'embryo,sex differentiation of rat embryos began to appear,the original male sex cord began to form,but it was still not easy to identify the typical ovarian characterized structure in female gonadal.But the initial shape of mouse embryo gonadal morphology was obviously found on the 14.5 days'embryo.The original male sex cord began to differentiate to the solid original spermatogenic tubules.But the female embryonic gonads had two layers,and showed the initial formation of ovarian characteristics.On the 15.5 days'embryo,the prototype of the seminiferous tubules had been obviously observed in the gonads of male embryonic rats, and the female embryos ovarian characteristics were also clearly found.Therefore,the time of the rat gonads differentiation was on the 13.5th day and the gonad characteristics significantly was on the 15.5th day.

Rat embryo Primordial germ cells Gender identification Gonadal differentiation

A

1003-4331（2016）06-0017-04

许丽惠（1987-），女，福建龙海人，硕士，助理实验师，从事基础兽医学的研究。E-mail：xulihui314@qq.com。

*通信作者：王全溪，副教授，博士，硕士生导师，E-mail：wqx608@126.com。