癌抗原15-3酶促化学发光免疫分析方法的建立

程缤雁

（北京北方生物技术研究所有限公司，北京100076）

癌抗原15-3酶促化学发光免疫分析方法的建立

程缤雁

（北京北方生物技术研究所有限公司，北京100076）

目的 建立癌抗原15-3（CA15-3）酶促化学发光免疫分析方法。方法 利用双抗体夹心法建立CA15-3化学发光检测体系，分别对该体系的最低检测限、线性、分析特异性、准确度和精密度进行评估，并与进口全自动化学发光检测结果进行对比。结果 本方法灵敏度为0.26 U/mL，线性范围为0～300 U/mL，与CEA和CA125无交叉反应，添加回收率在97.0%～105.6%之间，分析内与分析间CV均小于10%，与进口全自动化学发光试剂同时检测160份样本的CA15-3浓度，检测结果的线性相关系数为0.987。结论 成功建立了CA15-3酶促化学发光免疫分析方法。该方法灵敏度高、重复性好，在临床应用中可替代进口化学发光检测试剂。

肿瘤标志物； 癌抗原15-3； 乳腺癌； 酶促化学发光法

癌抗原15-3（CA15-3）是一种粘蛋白型糖蛋白，相对分子质量约为400000，是目前应用最广泛的乳腺癌血清标志物［1］。CA15-3在乳腺癌早期灵敏度不足，阳性率仅为10.1%，随着病情进展灵敏度有所增加［2］；发生转移时，70%的患者血清CA15-3会显著增高［3］；乳腺癌患者在临床治疗有效的情况下，血清CA15-3测值会降低［4］。检测血清CA15-3浓度，对乳腺癌患者疗效观察和预后估计有重要的意义。酶促化学发光免疫分析方法具有灵敏度高、特异性好、检测范围宽等优点。本工作利用双抗夹心法建立了CA15-3酶促化学发光免疫分析方法，对国内乳腺癌的治疗和检测有重要的意义。

材料和仪器

1 主要仪器

化学发光仪：厦门天中达生物科技有限公司。

2 主要材料与试剂

CA15-3单克隆抗体：Hytest公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）：Sigma公司产品；化学发光板：NUNC公司产品；去激素血清、小牛血清：天津康源生物技术有限公司产品；血清样本由北京中同蓝博临床检

验所提供。

3 方法

3.1 固相抗体包被板的制备 用0.02mol/L PB（pH 7.4）稀释CA15-3单抗至终浓度为4 μg/mL，100μL/孔加入化学发光板中，置于4℃过夜。次日甩弃包被液，再加入蔗糖封闭液150μL/孔，置于37℃温育。2h后，甩弃封闭液，将包被板自然晾干。

3.2 辣根过氧化物酶标记抗体的制备 参照郭春祥等［5］简易高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的 CA15-3抗体。将0.5 mg HRP溶于0.25 mL蒸馏水中，向其中缓慢滴加100 μL NaIO4（0.1mol/L）溶液，4℃搅拌20min后在HAc-NaAc缓冲液（1 mmol/L，pH 4.4）中透析过夜。次日，将碳酸缓冲液（0.0 5 mol/L，pH 9.6）透析的 CA15-3单抗缓慢滴加到活化的酶溶液中，室温避光搅拌。2h后，加入50 μL NaBH4中止反应，将溶液在 4℃静置2h后转入透析袋，在磷酸缓冲液（0.02mol/L，pH7.4）中透析过夜。次日取出，加入等体积甘油，分装后在-20℃长期保存。

3.3 校准品的制备 用去激素血清将CA15-3纯品分别稀释为5、20、80、160、300 U/mL。用CA 15-3全自动化学发光试剂盒测定各点浓度，标识为S1～S5，作为CA15-3校准品。1 mL/瓶分装，-20℃冻存。

3.4 分析程序 向CA15-3包被板孔中依次加入150 μL样本稀释液、20 μL校准品或样品，37℃温育30min后用洗涤液冲洗3次并拍干；每孔加入100 μL酶标抗体，37℃温育30min后用洗涤液冲洗3次并拍干；加入100 μL发光底物液，3～10min后测量每孔光子数。以光子数为纵坐标，校准品浓度为横坐标进行双对数作图，拟合校准品曲线方程。将样本的发光计数代入方程，即可计算出样本中CA15-3的浓度。样本稀释液为含20%小牛血清的磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）。

4 数据分析方法

采用Excel 2003分析。

结 果

1 酶标抗体工作浓度的选择

制备酶标抗体稀释比例分别为1∶10000、 1∶20000、1∶40000、1∶80000的溶液，在包被浓度为4 μg/mL时，观察不同浓度HRP-CA15-3对校准品曲线的影响，结果如图1所示。根据校准品曲线的线性相关系数，选择酶标抗体的工作浓度为1∶20000。

2 包被浓度的选择

制备包被浓度分别为 2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的CA15-3固相抗体板，HRP-CA15-3浓度为1∶20000时，观察不同包被浓度对校准品曲线的影响，结果如图2所示。包被浓度为4 μg/mL和8 μg/ mL时，校准品曲线的线性相关系数均为0.999，以节约原料为原则，选择包被浓度为4 μg/mL。

3 反应条件的确定

3.1 加样量 样本稀释液加样体积为150 μL

时，选取10 μL、20 μL、50 μL校准品加样体积进行对比分析，结果如图3所示。考虑到加样准确性和校准品曲线的线性相关系数，本分析方法选用20 μL校准品，150 μL样本稀释液进行反应。

3.2 反应时间 本分析方法采用两步法，加入稀释液和样本后分别温育0.5h、1h、2h、3h、4h，在第二步温育1h时，对比分析第一步反应温育时间对发光计数的影响。由图4可以看出，第一步反应0.5h即可达到平衡，故选取第一步温育时间为0.5h。在第一步温育0.5h时，加入酶标抗体分别温育0.5h、1h、2h、3h，对比分析第二步温育时间对发光计数的影响。由图5可以看出，第二步反应0.5h也可达到平衡。故本分析方法选取0.5h+0.5h的反应模式，满足了市场快速检测的需求。

4 方法学鉴定

4.1 校准品曲线及最低检测限 同时测定20孔S0，计算其发光计数（RLU）的均值x和标准差s，以x±2s为Y值，代入校准品曲线公式，计算出相对应的浓度值为0.26 U/mL，即为本方法的最低检测限。

4.2 线性 将一份CA15-3高值样本用样本稀释液倍比稀释，测定值如表1所示。稀释度与测定值的相关方程为 Y=1232.9X+5.8，r=0.998，表明本分析方法在0～300 U/mL范围内线性关系良好。样本稀释曲线如图6所示。

表1 不同稀释倍数血样测定结果（U/mL）

4.3 分析特异性 用去激素血清分别配制浓度为1000 ng/mL的CEA和1000 U/mL的CA125溶液，本方法测定结果分别为0.18 U/mL和0.22 U/mL。

4.4 准确度 向两份含不同浓度CA15-3的血清中加入已知量的校准品，对其测量并计算添加回收率，即为本分析系统的准确度。实验结果如表2和表3所示。本方法的回收率为97.0%～105.6%。

表2 1#样本添加回收实验（U/mL）

表3 2#样本添加回收实验（U/mL）

4.5 分析内与分析间精密度 对高、中、低三份样本，分别在同次实验中平行测量20孔，计算分析内精密度；分别在10次实验中重复测量，计算分析间精密度。结果如表4和表5所示。

表4 分析内精密度结果（n=20，U/mL）

表5 分析间精密度结果（n=10，U/mL）

4.6 相关性实验 使用ADVIA Centaur CA15-3 ReadyPack全自动化学发光试剂（西门子医学诊断产品有限公司，批号：043160）与本方法同时测定160份样本的CA15-3浓度，相关性见图7，相关性方程为：Y=0.968X+1.538，r=0.987。

结 论

血清CA15-3含量对乳腺癌患者的疗效观察和预后估计具有重要的意义。本研究利用双抗体夹心法研制的CA15-3酶促化学发光免疫分析试剂盒，最低检测限为0.26 U/mL，在0～300 U/mL范围内线性关系良好，与高浓度CEA和CA125无交叉反应，分析内、分析间CV均小于10%，与进口全自动化学发光试剂检测结果的线性相关系数为0.987。此外，本试剂盒无需进行样本稀释，方便临床检验操作；反应时间仅需一小时，能够满足快速检测的市场需求。在临床工作中具有广阔的应用前景。

［1］Duffy M J，Evoy D，McDermott E W.CA15-3：Uses and limitation as a biomarker for breast cancer.Clin Chim Acta，2010，411（23-24）：1869-1874.

［2］Sandri M T，Salvatici M，Botteri E，et al.Prognostic role of CA15.3 in 7942 patients with operable breast cancer.Breast Cancer Res Treat，2012，132（1）：317-326.

［3］Ohuchi N，Sato S，Akimoto M，et al.The correlation between the immunohistochemical expression of DF3 antigen and serum CA15-3 in breast cancer patients.Jpn J Surg，1991，21（2）：129-137.

［4］Brouckaert O，Laenen A，Wildiers H，et al.The prognostic role of preoperative and（early）postoperatively change in CA15.3 serum levels in a single hospital cohort of primary operable breast cancers.Breast，2013，22（3）：254-262.

［5］郭春祥，郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983，3（2）：97-100.

（张增武编辑）

《标记免疫分析与临床》杂志继续入选2016版“中国科技期刊（核心版）”目录

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《标记免疫分析与临床》创刊以来，在各位编委、专家学者、作者等同仁的共同努力下，在各位读者的支持下，经历了由季刊、双月刊到月刊的蜕变，影响因子逐年升高，2016版《中国科技期刊（核心版）》目录中，本刊核心影响因子为0.541，《中国科技期刊（扩刊版）》目录中，影响因子为0.978。

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《标记免疫分析与临床》杂志社

2016年10月18日

Development of a Chemiluminescent Immunoassay for Cancer Antigen 15-3

CHENG Bin-yan
（Beijing North Institute of Biological Technology，Beijing100076，China）

Objective To evaluate using chemiluminescent immunoassay（CLIA）system to detect serum cancer antigen 15-3（CA 15-3）.Methods The system was evaluated in its limit of detection，linearity，analytical specificity，accuracy and repetitiveness.A total of 160 clinical specimens were detected and evaluated.Results The limit of detection was 0.26 U／mL and the recovery rate for accuracy was 97.0%-105.6%.The assay had a good linear relationship between 5-300 U／mL and had no cross reaction with CEA and CA125.All samples were detected by two CLIA systems，and the results were consistent and trusted.Conclusion The CLIA system for detecting CA15-3 has been established，which has satisfied sensitivity，repeatability，and will be widely used in clinical testing.

Tumor marker； Cancer antigen 15-3； Breast cancer； Chemiluminescence enzyme immunoassay

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.031

2016-05-20；

2016-06-11