应用cDNA-SRAP标记比较苹果梨与延光梨果皮性状的表达差异

崔百会，金炳奎，杨 洋，曹后男，宗成文

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)



应用cDNA-SRAP标记比较苹果梨与延光梨果皮性状的表达差异

崔百会，金炳奎，杨 洋，曹后男，宗成文*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

以苹果梨和延光梨果皮为试材，对盛花后7 周的苹果梨和延光梨果皮cDNA进行SRAP-PCR检测，找出2个梨品种(系)在转录水平的差异，共扩增出444条可被应用的条带。2个品种间的相似性极高，仅检测到2个差异片段，多态性为0.45%。其中，ME7-EM5引物组合扩增出的差异条带是因为核苷酸序列包含内含子序列，为模板中存在的少量DNA扩增；ME4-EM3引物组合扩增出的差异条带经回收测序，于Blast上比对得知其为植物凝集素基因，经半定量RT-PCR验证多态性消失，判断差异条带可能是由于苹果梨与延光梨引物结合位点存在差异而致。

苹果梨；延光梨；芽变；cDNA-SRAP

苹果梨引自朝鲜，为经过繁殖和栽培发展起来的一个品种[1]，是我国东北地区最受欢迎的水果之一[2]。延光梨[3]是苹果梨的一种果皮褐色型的芽变。果实的外形和色泽均是影响其商品价值的重要指标，也是果树育种中很重要的部分。关于果实色泽方面的研究已有诸多报道[4]。长期以来，由于雄性不育等原因，苹果梨杂交育种比较困难。相对于杂交育种，果树芽变选种周期短、育种进程快，是果树创新育种的重要途径[5]。现今，已有许多果树的芽变经选种成为优良的栽培品种，如柑橘[6]、桃[7]、甜橙[8]、苹果[9]、樱桃[10]等。

芽变的发生使得突变体与原品种之间形成差异，导致植株表型的改变。大多数木本果树童期较长，重要性状的芽变对于果树变异性状发生机制的研究非常重要。分子标记技术是研究植物突变机理的有效方法[11-12]，克服了AFLP[13]技术复杂，RAPD[14]重复性差，成本昂贵的缺点，SRAP标记技术[15]以其操作简单、重复性高、可靠性好、成本低等一系列优点得到广泛应用。本研究应用cDNA-SRAP标记技术探索苹果梨芽变机制，探索苹果梨与延光梨在分子水平的差异。为苹果梨褐色芽变机理提供理论依据，为苹果梨的创新育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所需苹果梨和延光梨的果实均采自延边大学苹果梨实验基地，差异表达分析选取盛花后7周的果皮为材料，此时期为延光梨果皮褐变的关键时期[3]。

1.2 试剂及引物

rTaq酶(5 U/μL)等生化试剂均购自宝生物(大连)有限公司；引物由南京基天生物技术有限公司合成，序列信息如表1所示。

表1 SRAP引物序列信息

Table 1 Total sequences of SRAP primers

1.3 RNA的提取与cDNA-SRAP扩增

以苹果梨与延光梨不同发育时期的果皮为材料，经改良的CTAB法[16]提取2个样品的总RNA，以Oligo(dT)18为反转录引物，利用Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶，合成cDNA第1链。对盛花后7周的苹果梨与延光梨果皮cDNA 的Actin基因进行扩增比较，调节模板 cDNA 的体积，使Actin基因的表达量相同，保证苹果梨与延光梨的初始模板用量一致。应用表1中14个上游引物与11个下游引物两两组合得到的154对引物组合对2者进行SRAP-PCR扩增，其反应条件为：95 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 45 s ,50 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s ，30个循环;72 ℃延伸5 min。

1.4 差异片段的克隆与测序

PCR扩增后用1%的琼脂糖凝胶检测并找出差异条带。按Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0说明书方法，进行目的片段的回收；将回收的片段与pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑和菌液PCR筛选带有目的片段的克隆，送Invitrogen(上海)公司测序。根据测序序列设计引物，引物序列如下：

护士应营造一个温馨、舒适的病房环境，避免接种儿童对陌生环境的紧张和恐惧感；同时注意保持接种室的干净、清洁，定期消毒，避免发生交叉感染；接种室内的温度、湿度、光线等都应控制良好，避免过冷或过热，导致儿童不舒适；在接种室墙壁上张贴一些卡通漫画，播放一些动画片等，有利于提高亲切感和儿童预防接种的依从性[3] 。

应用上述引物对盛花期后的7个不同时期对苹果梨与延光梨进行RT-PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 苹果梨与延光梨总RNA提取

苹果梨与延光梨果皮的总RNA电泳检测如图1所示，所提取的RNA无其它杂质残留，质量可用于后续试验。

图1 苹果梨(P1,P2)与延光梨(Y1,Y2)总RNA

2.2 苹果梨与延光梨果皮cDNA-SRAP扩增分析

对盛花后7周的苹果梨与延光梨的果皮进行cDNA-SRAP的扩增，结果如图2所示。

图2 苹果梨与延光梨cDNA-SRAP扩增

Fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

M：Marker；a-b：MEa-EMb，为1对引物组合。每对引物组合对应的2条泳道左侧为苹果梨，右侧为延光梨。

续图2 苹果梨与延光梨cDNA-SRAP扩增

Continue to fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

应用154对引物对苹果梨和延光梨进行扩增，其中，有3对引物组合(ME6-EM2、ME6-EM11、ME9-EM11)没有扩增出条带，剩余的151对引物均扩增出条带。统计各组引物扩增所产生的带数，除2对引物组合(ME4-EM3、ME7-EM5)扩增出差异条带，其余149对引物组合均扩增出相同的条带。每对引物组合扩增出的条带数为2～6条，2个样本均扩增出443条条带，品种间的差异条带为2条，多态性为0.45%。

经测序分析，ME7-EM5扩增出差异条带是因为1条核苷酸序列包含内含子序列，为模板中存在的少量DNA扩增；对ME4-EM3扩增出的差异片段进行序列分析及多序列比对，并做进一步分析。

2.3 差异片段的序列分析

将ME4-EM3扩增出的差异条带进行测序后，根据测序序列设计引物，对盛花期后的7个不同时期对苹果梨与延光梨进行RT-PCR扩增。经Blast[17]比对并通过CluctalX 1.83软件进行多序列比对，应用Gene Doc软件输出比对结果。

ME4-EM3扩增出的差异基因长936 bp，编码311个氨基酸(图3)。

图3 差异基因序列及所编码的氨基酸序列

多序列比对结果如图4所示，此基因的氨基酸序列与梅花(Prunusmume，XP_008226191)、苹果(Malusdomestica，XP_008383184)、大豆(Glycinemax，XP_006597996)、绿豆(Vignaradiatavar.radiata，XP_014492351)的凝集素基因同源性分别为74%、69%、40%和39%。据此基本可以判定此基因片段可能为植物凝集素基因，梁峰等[18]人研究表明，此基因与植物防御系统有很大的相关性。

图4 苹果梨植物凝集素基因其他植物的氨基酸序列对比

根据测序得到的数据设计引物并对苹果梨和延光梨各个时期果皮进行PCR扩增，在苹果梨与延光梨果皮中均可扩增出条带(图5)，其原因可能是用ME4-EM3这对引物组合进行PCR扩增时，引物结合位点突变而产生多态性，根据测序结果重新设计引物时，由于位点发生变化而导致多态性消失。

1.盛花后2周；2.盛花后4周；3.盛花后6周；4. 盛花后8周；5.盛花后10周；6.盛花后12周；7.采收前1周

3 讨论与结论

王月志等[19]对梨已育成的芽变品种(品系)进行整理分析得出，果实皮色芽变由木栓等合成途径中的基因变异引起；曾继吾等[20]对“春甜橘”及其突变体的果皮差异分析推测，可能是由参与类黄酮生物合成过程的基因的差异表达导致的二者表型差异；张俊苗等[21]对红富士苹果芽变的一些生物学性状进行分析,得出其芽变是在果品、果型等综合性方面均优良的变异材料。

本试验拟探索苹果梨褐色芽变品种——延光梨的变异机理及其果皮褐色性状的形成机制。利用cDNA-SRAP标记技术筛选出2个品种间存在的差异基因片段，测序分析后得知其为植物凝集素基因[22]。根据测序结果重新设计引物利用半定量RT-PCR检测后多态性消失，判定延光梨与苹果梨的引物结合位点可能不同，从而扩增出差异片段。而二者间不同的引物结合位点是否是导致果皮结构甚至功能间差异的根本原因，需进一步深入研究。

[1] 王雪，曲柏宏，鹿艳新，等.苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达分析[J].北方园艺，2016(05):108-112.

[2] Ma J N,Wang S L,Zhang K,et al.Chemical components and antioxidant activity of the peels of commercial apple-shaped pear (fruit ofPyruspyrifoliacv.pingguoli)[J].Journal of Food Science,2012,77(10):1097-1102.

[3] 金炳奎. ‘苹果梨’褐色突变体果皮性状形成机理的研究[D].延吉：延边大学， 2013.

[4] 孙百灵，王旭，曲柏宏.苹果梨果实着色相关PAL基因片段克隆及表达分析[J].延边大学农学学报，2012,34(01):1-5.

[5] 伊凯，闫忠业，刘志，等.苹果芽变选种鉴定及应用研究[J].果树学报，2006,23(05):745-749.

[6] Bowman K D,Gmitter F G,Moore G A,et al,Citrus-fruit sector chimeras as a genetic resource for cultivar improvement[J].Journal of the American Society for Horticultural Science,1991,116:888-893.

[7] 陆爱华，聂云，柯贤良，等.油桃极早熟新品种金山早红[J].中国果树，2001(05):1-2.

[8] 程昌凤，刘昌文，程昌文，等. 汁用甜橙新品种“渝红橙”[J].园艺学报，2009,36(01):148.

[9] 刘勇.国光苹果芽变选种及其生物学特性研究[D].泰安：山东农业大学，2011.

[10] 张福兴，孙庆田，刘美英，等.甜樱桃新品种砂蜜豆的选育[J].中国果树，2008(05):10-11.

[11] 李文滨，赵雪.2009年大豆分子标记及辅助选择育种研究进展[J].东北农业大学学报，2010,41(01):139-148.

[12] 赵丹,张宪红,裴崎君,等.分子标记在杨树育种上的应用[J].长春大学学报,2007,17(03):84-87.

[13] 李传友，郑洪刚，翁曼丽，等.光敏核不育水稻等位突变系的AFLP分析[J].生物工程学报，2000,16(01):95-99.

[14] 孙宁，孙建设，李增裕.苹果砧木耐盐突变体的筛选鉴定及RAPD分析[J].河北农业大学学报，2004,27(05):37-40.

[15] 李亚利，于铁峰，罗爱玉，等.SRAP分子标记在茄果类蔬菜航天诱变育种中的应用[J].中国农学通报，2015,31(28):60-64.

[16] 巩艳明.梨极矮化突变体S基因型鉴定与DELLA蛋白编码基因的克隆[D].延吉：延边大学，2011.

[17] 高颖，李梦竹，冯紫洲，等.蓖麻PAL基因片段的克隆与序列分析[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版)， 2013,28(02),179-182.

[18] 梁峰，常团结.植物凝集素的研究进展[J].武汉大学学报(理学版)，2002,48(02):232-238.

[19] 王月志，戴美松，张树军，等.我国梨芽变育成品种分析及芽变性状变异机制研究进展[J].果树学报，2012,29(04):676-682.

[20] 曾继吾，邓贵明，高长玉，等.“春甜橘”及其突变体果皮差异相关蛋白质组分析[J].中国农业科学，2015,48(24):4965-4978.

[21] 张俊苗，邓代君，史进，等.短枝条红型红富士苹果芽变的生物学特性研究[J].新疆农业科学，2016,53(02):240-247.

[22] 于敏，袁萍萍，章莹莹.植物凝集素的部分生物学作用分析[J].安徽农业科学，2002,30(01):155-156.

Analysis of gene expression difference of peel characters between Pingguoli and Yanguangli by cDNA-SRAP markerss

CUI Baihui, JIN Bingkui, YANG Yang, CAO Hounan，ZONG Chengwen*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Make the peel of Pingguoli and Yanguangli at 7 weeks after full bloom as materials, the difference between the two pear cultivar’s (lines) was determined by using cDNA-SRAP technology at the level of transcription. As the result, 444 bands were amplified from cDNAs of the peels of Pingguoli and Yanguangli with only 2 different bands. The two cultivars were highly related with low polymorphism of 0.45%. The 2 polymorphic bands were amplified with primer combinations of ME7-EM5 and ME4-EM3. The polymorphic bands amplified with ME7-EM5 primer combination resulted from the introns involved, whereas the polymorphic band amplified with ME4-EM3 primer combination was a partial fragment of Lectin gene revealed by blast.

Pingguoli; Yanguangli; bud sport; cDNA-SRAP

2016-04-20 基金资助:国家自然科学基金项目(31460504)；吉林省科技支撑计划重点项目(20120251)

崔百会(1990—)，女，吉林四平人，在读硕士，研究方向为果树生物技术。宗成文为通信作者，

E-mail:zongchengwen@aliyun.com

1004-7999(2016)03-0192-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.002

S661.2

A