软枣猕猴桃雌雄株叶片中多胺含量的高效液相色谱检测

徐聆粤，姜 丹，郭梦玉，黄圆博，朴一龙

(延边大学农学院，吉林 延吉 133000)



软枣猕猴桃雌雄株叶片中多胺含量的高效液相色谱检测

徐聆粤，姜 丹，郭梦玉，黄圆博，朴一龙*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

植物体内源多胺含量与植物性别有关，为了鉴定软枣猕猴桃雌雄株性别，本试验采用高效液相色谱法对始花期软枣猕猴桃雌雄株叶片测定了腐胺、亚精胺和精胺的含量。结果表明：检测条件以苯甲酰化反应温度37 ℃，25 min，色谱柱为 C18(150 mm×4.6 mm 3 μ)柱，柱温40 ℃，流动相A为甲醇，B为水，体积比为64∶36，流动相的流速0.6 mL/min，检测波长230 nm为最佳。软枣猕猴桃始花期雄雌株中，雄株叶片中腐胺含量显著高于雌株，雌株叶片中精胺含量显著高于雄株，雌雄株叶片中亚精胺含量无显著差异。

软枣猕猴桃；雌雄株；高效液相色谱法；多胺；苯甲酰化

软枣猕猴桃是一种光果猕猴桃种类之一，被誉为“世界之珍果”[1]，是猕猴桃属中在我国地域分布最广泛的野生果树之一[2]。目前软枣猕猴桃在世界各地被称为第3代猕猴桃，与我们所熟知的中华猕猴桃、美味猕猴桃相比更具有保健价值。其植株为雌雄异株植物，不同性别的植株中各种内源物质的含量及对环境的适应能力也有差异。

多胺是高等植物体内不可缺少的生理活性物质，其种类主要有腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)，它们不仅参与了植物各种生长发育过程[3]，还与抗逆性密切相关[4]。研究表明，多胺在一定浓度范围内有促进植物生长与分化、延缓许多双子叶和单子叶植物离体叶片衰老的作用[5-6]。多胺还与植物的性别分化有关，对植物雌雄蕊的发育具有调节作用。大量研究表明,外源喷施腐胺、亚精胺与精胺能够增加植物花芽的数目,特别是在内源水平低的情况下,促进花芽形成的效果更加明显[7-8]。陈坤明等则认为，亚精胺和精胺的累积是增强作物抗旱性的主要因素[9]。

多胺在人体内也起到至关重要的作用。多胺主要存在于植物体内，人类可以通过食物摄取多胺，人体内少量的多胺可以通过自身代谢排出体外，但摄入量过多时会对身体造成伤害。因此，如何高效快速地检测植物中的多胺含量成为了人们越来越关注的内容。检测多胺常采用化学发光法、电化学检测法、薄层色谱法等，但是这些方法都存在实验结果不准确、检测效率低等问题。经过长期研究和技术更新，现在多采用高效液相色谱法或反高效液相色谱法检测，效率高、结果精准。刘俊等[10]研究了高效液相色谱法检测组织中多胺含量的方法，但利用该方法检测多胺含量也存在如何正确选择色谱条件、异常峰的处理等多方面问题。刘华英等[11]探讨了苯甲酰化反应的最佳条件和色谱条件。在研究雌雄异株植物中多胺含量的差异时，不同植物种类的检测结果不同，而且还存在一些争议，对于软枣猕猴桃雌雄株中多胺含量的检测也少有相关研究。

本试验仅以始花期的软枣猕猴桃雌雄株叶片为材料，采用高效液相色谱法测定其叶片中腐胺、亚精胺、精胺的含量并进行比较，为今后软枣猕猴桃多胺含量测定及雌雄株的鉴别提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料于2014年6月3日取自延边大学农学院软枣猕猴桃资源圃，选取8年生树势中庸、无病虫害、无机械损伤的软枣猕猴桃雌雄株各5株，摘取其雌雄株叶片若干，装入冰盒运回实验室，液态氮研磨后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

高效液相色谱仪(日本岛津公司的LC-2010A HT)，色谱柱(Adsorbosphere HS C18150 mm×4.6 mm 3 μ)，超声波清洗器，涡旋仪，水浴锅，离心机(Himac CR22G)，氮吹仪，电子天平，恒温干燥箱，针筒式滤膜(0.45 μm，有机系)。

1.2.2 试剂

腐胺(put)、亚精胺(spm)、精胺(spd)3种标准品均为sigma公司产品，甲醇为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯，实验用水为双蒸水。

1.3 方法

1.3.1 样品处理和测定

材料处理方法参考Flores H E等[12]的方法并稍作改动。选取软枣猕猴桃雌雄株叶片各1.60 g，用液态氮充分研磨至粉末，加入2 mL预冷的5%高氯酸溶液继续研磨后，转入14 mL离心管中，再用2 mL的5%高氯酸溶液冲洗研钵并转入离心管中涡旋混匀，冰浴浸提1 h，再以10 000 r/min、4 ℃的条件下离心40 min，取500 μL上清液，加入1 mL 2 M的NaOH和7 μL的苯甲酰氯涡旋20 s充分混合均匀，37 ℃水浴反应25 min完成后，加入2 mL饱和NaCl涡旋混匀、再加入2 mL乙醚，以5 000 r/min离心5 min，收集1 mL上层醚相，用氮吹仪吹干，再次加入1 mL乙醚吹干，用500 μL甲醇溶解后，过0.45 μm滤膜，取10 μL进样。

1.3.2 标准曲线的制作

混标配制参考赵雪萍等[13-14]的方法，并略加改进。准确称取腐胺、亚精胺、精胺0.004 5、0.005 4和0.006 8 g，用预冷的5%高氯酸溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，放进超声波清洗器中3 min后，准确移取以上3种多胺标准溶液各100 μL混合均匀制成混合母液，再取100 μL母液进行苯甲酰化反应，步骤同上。分别取苯甲酰化后的多胺标准液依次稀释1倍、5倍、12.5倍、25倍和50倍配制成混合标准系列，取10 μL进样，用液相色谱仪分析测定，以峰面积对浓度分别绘制腐胺、亚精胺、精胺的工作曲线。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为 C18(150 mm×4.6 mm 3μ) 柱，柱温40 ℃，检测波长230 nm。以甲醇和水作为流动相，体积比设定为V甲醇∶V水= 64∶36，流速为0.6、0.7和0.8 mL/min。

1.3.4 数据分析

样品重复3次，取平均值，试验数据用SPSS19.0软件进行统计分析，数值以平均数±标准误差表示，采用独立样本T检验作显著性差异分析，显著水平为0.05、0.01。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

在波长230 nm、甲醇浓度64%条件下，不同流速对3种多胺分离的影响结果如表1。流速V=0.6 mL/min时，3种多胺峰面积表现出明显优势，各胺峰面积均大于流速V=0.7 mL/min和V=0.8 mL/min时各峰面积值，通常用分离度R=1.5作为两峰完全分离的标志，而流速V=0.7、0.8 mL/min时，分离度过小，保留时间过于相近，3种多胺不能较好地分离。综合考虑，以流速V=0.6 mL/min作为分离条件效果较好。3种多胺的检测可以得到满意的基线分离(图1)，样品也可在15 min内完成检测。

表1 不同流速对多胺检测的影响

图1 多胺标准品的HPLC色谱图

2.2 软枣猕猴桃雌雄株叶片中多胺的测定

2.2.1 软枣猕猴桃雌株叶片中多胺的测定

由图2可知，软枣猕猴桃雌株叶片中的亚精胺出峰面积显著高于其他2种多胺，精胺出峰面积小于亚精胺但大于腐胺，腐胺峰面积相对最少。腐胺、亚精胺、精胺的出峰时间分别为4.55、5.91和12.47 min。

图2 软枣猕猴桃雌株叶片中多胺的液相色谱图

2.2.2 软枣猕猴桃雄株叶片中多胺的测定

由图3可知，在软枣猕猴桃雄株始花期叶片中3种多胺的峰面积差异显著，腐胺出峰面积最高，显著高于亚精胺和精胺，精胺出峰面积相对最小。腐胺和亚精胺、精胺的出峰时间分别为4.55、5.90和2.47 min。

图3 软枣猕猴桃雄株叶片中多胺的液相色谱图

2.3 软枣猕猴桃雌雄株叶片中多胺含量差异

由表2可知，在软枣猕猴桃雌雄株始花期阶段，雄株叶片中腐胺含量显著高于雌株(P<0.05)，雌株叶片中精胺含量显著高于雄株(P<0.01)，雌雄株叶片中亚精胺含量无显著差异。因此，在始花期软枣猕猴桃雌雄株叶片中腐胺、精胺含量可作为雌雄株差异的鉴别指标。

表2 软枣猕猴桃雌雄株叶片多胺含量比较

注:*和**分别表示在P<0.05和P<0.01 水平上显著性分析。

2.4 标准曲线的绘制

由于软枣猕猴桃叶片中多胺的含量很低，在试验中选择较低浓度的多胺进样，3种多胺的工作曲线见图4。

腐胺、亚精胺、精胺的相关系数R2分别为为0.998 2，0.999 8和0.999 7。腐胺、亚精胺最低检测限为0.3 μg/mL，精胺最低检测限为0.4 μg/mL。腐胺、亚精胺、精胺3种多胺分别在0.3～7.5、0.4～11.3和0.3～9 μg/mL时，标准曲线呈良好线性关系。

图4 3种多胺标准品的工作曲线

3 讨论与结论

植物性别和体内多胺水平存在某种关系[15]。而且不同种类多胺在不同的植物种类或同一植物不同的器官中含量是不同的[16]。多胺的含量变化在不同育性的植物中存在一定差异，说明多胺与雄性不育的发生存在着一定关系。在菜豆雌蕊中腐胺、亚精胺、精胺的水平分别比雄蕊高出5倍、6倍和25倍。该试验中，在软枣猕猴桃始花期，雄株叶片中腐胺含量显著高于雌株，雌株叶片中精胺含量显著高于雄株，雌雄株叶片中亚精胺含量无显著差异。说明腐胺含量的变化可能与雄花的分化有关，精胺含量的变化可能与雌花的发生与发育有一定的相关性。汪俏梅等[17]在苦瓜(MomordicacharantiaL.)性别分化研究中也发现类似结果。研究结果表明，栝楼植株在始花期阶段，其内源植物多胺的含量不同，雄株腐胺和精胺含量显著高于雌株，雌株亚精胺含量显著高于雄株[18]。但Rita等[19]研究结果表明，猕猴桃(Actinidiadeliciosa)雌雄花药中多胺含量存在着差异，雄性不育的花药中多胺的含量高于可育的花药，尤其是植物接近开花时差异更大。Biasi等[20]研究猕猴桃生殖器官发育与多胺的关系表明，雌花比雄花含有更高的游离态多胺。多胺对高等植物性别分化的调控作用日益引起人们的重视，但研究结果还有分歧、或存在尚未开展的问题，还需要继续深入研究。

1) 在甲醇浓度为64%的条件下以流速V=0.6 mL/min作为分离条件效果较好。3种多胺的检测可以得到满意的基线分离，样品也可在15 min内完成检测。

2) 雌株的腐胺、亚精胺、精胺含量分别为81.56、128.58和60.88 nmol/g。雄株的腐胺、亚精胺、精胺含量分别为362.97、153.03和30.59 nmol/g。

3) 软枣猕猴桃始花期雄株叶片中腐胺含量显著高于雌株，雌株叶片中精胺含量显著高于雄株，雌雄株叶片中亚精胺含量无显著差异。

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Determination of polyamine content in leaves of the male and female plants of Actinidia arguta by HPLC

XU Lingyue，JIANG Dan，GUO Mengyu，HUANG Yuanbo，PIAO Yilong*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

Endogenous polyamine content is related with sex development of plants. In order to identify male and female plants, contents polyamines including putrescine, spermidine polyamine and spermine in male and female plant leaves ofActinidiaargutaat the early flowering stage were determined by HPLC method. The results showed that the optimum determination condition was 37 ℃ for 25 min, chromatographic column C18 (150 mm × 4.6 mm 3μ) with column temperature 40 ℃ maintained, the mobile phase with the ratio of 64% methanol and 36% water, the flow velocity 0.6 mL/min and the detection wavelength 230 nm. At the early flowering stage ofActinidiaarguta, the putrescine content in female plant leaves was significantly higher than that in male plant leaves, the spermine content of male plant leaves was significantly higher than that in female plant leaves, whereas spermidine contents in male and female plant leaves were not significantly different.

Actinidiaarguta；male and female plants ；HPLC; polyamines；benzoylating

2016-05-12 基金项目：国家自然科学基金(31160068)

徐聆粤(1992—)，女，吉林长春人，在读硕士,研究方向为果树栽培生理。朴一龙为通信作者，

E-mail：piaoly@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0220-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.007

S663.4

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