响应面优化纤维素酶法提取绣球菌多糖

蒋孟如,王锡昌,胡晓倩,陶宁萍

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)



响应面优化纤维素酶法提取绣球菌多糖

蒋孟如,王锡昌,胡晓倩,陶宁萍

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

为了提高得率,本文采用纤维素酶提取绣球菌多糖。通过单因素实验考察了酶添加量、酶解温度、酶解时间、液料比、pH、对多糖得率的影响。在此基础上,选取对多糖得率影响较大的因素进行响应面优化分析。最优工艺为:酶添加量为1.3%、酶解温度为40 ℃、酶解时间2.5 h、液料比42 mL/g、pH为5.5,在此条件下多糖得率为22.90%±0.26%。

绣球菌,多糖,纤维素酶,响应面分析

绣球菌[Sparassiscrispa(Wulf.)Fr.],又名荷仙菇、花瓣菇等,隶属真菌界,担子菌门(basidiomycota),异隔担子菌纲(Heteroba-sidiomycetes)、无褶菌目(Aphyllophorales)、绣球菌科(Sparassidaceae)[1]。它是一种药食两用的真菌,含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等多种营养物质,此外还有丰富的活性多糖,据报道,绣球菌活性多糖以葡聚糖为主,其葡聚糖含量占干重的40%～50%[2],大量文献表明绣球菌多糖能提高人体免疫力[3]、改善机体造血功能,并具有抗癌、防癌[4-6]的功效。因此分离提取绣球菌中的活性多糖具有很好的应用前景。

目前,绣球菌多糖的提取工艺多采用热水浸提[7-8],但该方法得率较低。而酶法提取具有条件温和、绿色节能、产品品质好、得率高等特点[9],已在多种植物原料的多糖提取中得到应用[10-11]。洪小君等[12]采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶3种酶复合提取绣球菌多糖,有效提高了得率,但成本较高,并增加了后期多糖纯化难度。因此本研究拟选用单一纤维素酶处理提取多糖,通过单因素实验和响应面进行优化,以获得更为经济高效的绣球菌多糖提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干绣球菌子实体由上海荷仙菇股份有限公司提供 真空干燥箱中60 ℃烘干,粉碎过200目筛后放于干燥器中备用;纤维素酶(100000 U/g、最适pH4～5) 天津市诺奥科技发展有限公司;一水合柠檬酸、浓硫酸、苯酚 分析纯,国药集团有限公司;葡萄糖标准品 纯度≥98%,Sigma公司。

ZM200超离心研磨仪 弗尔德仪器设备有限公司;Kjeltec 8400全自动定氮仪、Soxtec自动索氏抽提系统、Fibertec 2010膳食纤维分析系统Fiber E FOSS福斯分析仪器公司;UV 2003紫外分光光度计 尼克龙(上海)仪器有限公司;恒温振荡器 优莱博技术(北京)有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;Avanti J-26xP真空冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 一般营养成分的测定 水分含量:参照GB/T20264-2006常压干燥失重法测定;灰分含量:参照GB/T5505-2008马弗炉550 ℃灼烧法测定;粗蛋白含量:参照GB/T5009.5-1985凯氏定氮法测定,测定总氮后,再乘以转换系数6.25,即为粗蛋白含量;粗脂肪含量:参照GB/T5009.6-2003食品中脂肪的测定方法索氏提取法测定;膳食纤维含量:参照AOAC 991.43酶-重量法(MES-TRIS缓冲液)测定。

1.2.2 绣球菌多糖的提取 参考李波等[13]方法作部分修改:取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按一定的液料比加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至4.5,然后加入适量的纤维素酶,一定温度下水浴振荡(120 r/min)一定时间后,迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液稀释数倍后进行测定。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,绘制葡萄糖标准曲线为y=15.05+0.0059,R2=0.9992,线性范围在0～0.05 mg/mL。

绣球菌多糖得率的计算公式:

式中:C为通过标准曲线得到的多糖的质量浓度,mg/mL;V为提取液的体积,mL;n为提取液稀释的倍数;M为绣球菌粉末的质量,g。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 酶添加量对多糖得率的影响 准确称取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至4.5,分别加入占原料质量分数的0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的纤维素酶,混合均匀,50 ℃水浴振荡2 h,迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液测定多糖含量。

1.2.3.2 液料比对多糖得率的影响 准确称取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按液料比10、20、30、40、50 mL/g加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至4.5,加入质量分数为1.2%的纤维素酶,混合均匀,50 ℃水浴振荡2 h,迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液测定多糖含量。

1.2.3.3 pH对多糖得率的影响 准确称取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,加入质量分数为1.2%的纤维素酶,混合均匀,50 ℃水浴振荡2 h,迅速于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液测定多糖含量。

1.2.3.4 酶解时间对多糖得率的影响 准确称取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至5.5,加入质量分数为1.2%的纤维素酶,混合均匀,50 ℃水浴振荡1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后取出,于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液测定多糖含量。

1.2.3.5 酶解温度对多糖得率的影响 准确称取5.0 g(精确至0.001 g)绣球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸馏水,低速搅拌至样品完全分散,用4 mol/L的柠檬酸调pH至5.5,加入质量分数为1.2%的纤维素酶,混合均匀,分别于40、45、50、55、60 ℃水浴振荡2.5 h,于95 ℃水浴中灭酶10 min,离心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液测定多糖含量。

1.2.4 响应面优化绣球菌多糖提取工艺 根据单因素实验的结果,选取对多糖得率影响较大的因素酶添加量(A)、液料比(B)、酶解时间(C)对绣球菌多糖提取工艺进行优化,以多糖得率为评价指标,利用Box-Behnken中心组合方法。实验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素和水平

1.3 数据处理

采用SPSS 21.0单因素方差分析中的LSD、S-N-K法、Origin8.0和Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行分析,每组实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 绣球菌的一般营养成分

由表2可知,绣球菌含有蛋白质、脂肪等一般营养成分,其中脂肪含量较低,总膳食纤维含量较高,符合健康食品的理念。与黄建成等人[14]的研究结果相比,本研究所测粗蛋白含量偏高和粗脂肪含量偏高,可能是因为绣球菌的栽培方式、培养基组成不同。其中,不溶性膳食纤维占总膳食纤维的67%左右,而纤维素作为不溶性膳食纤维的主要成分,是构成真菌类细胞壁的主要物质,故本研究采用纤维素酶破坏细胞壁,以提高绣球菌的多糖得率。

表2 绣球菌一般营养成分含量(g/100 g干重,n=3)

2.2 单因素实验

2.2.1 酶添加量对多糖得率的影响 由图1可知,随着酶添加量的增加,多糖得率先上升后趋于平稳。当酶添加量为1.2%时,多糖得率达到最大。可能是因为开始阶段,酶的活性部位与底物结合量增加,菌体的细胞壁逐渐被纤维素酶水解,胞内多糖溶出;但当酶活性部位与底物数量浓度饱和时,细胞壁被水解完全,胞内多糖完全溶出,体系趋于平稳。因此,酶添加量1.2%为宜。

图1 酶添加量对多糖得率的影响Fig.1 Effects of enzymatic addition on yield of polysaccharide注:字母不同代表不同多糖得率之间存在显著性差异(p<0.05)(图2～5同)。

2.2.2 液料比对多糖得率的影响 由图2可知,随着液料比的增加,多糖得率先增加后下降,当液料比为40 mL/g时,多糖得率最大。可能是因为液料比增加有利于水向细胞内扩散,利于多糖的溶出,但随着液料比的增加,胞内的杂质也易于溶出,造成的得率略有下降[15]。因此,液料比40 mL/g为宜。

图2 液料比对多糖得率的影响Fig.2 Effects of liquid/solid ratio on yield of polysaccharide

2.2.3 pH对多糖得率的影响 由图3可知,随着pH增加,多糖得率先增加后减少,当pH为4.5时,多糖得率最大。这与纤维素酶的最适pH为4.5有关。当偏离酶的最适pH时,酶活性中心的构象甚至整个酶分子结构发生改变,甚至会使酶发生变性而失活[16],从而导致细胞壁水解不完全,影响胞内多糖无法溶出。结果表明,pH在3.5～5.5范围内对多糖得率无显著影响(p<0.05),从经济和环保角度综合考虑,选取pH5.5为后期提取pH,且该因素不作为响应面优化因素。

图3 pH对多糖得率的影响Fig.3 Effects of pH value on yield of polysaccharide

2.2.4 酶解时间对多糖得率的影响 由图4可知,随着酶解时间的增加,多糖得率先增加后减少,当酶解时间为2.5 h时,多糖得率最大。可能是因为随着酶解时间的增加,纤维素酶水解细胞壁作用增强,使得多糖溶出增多;但达到一定时间后,多糖的大量溶出使溶液黏度较大,导致体系分散不均匀[17],影响纤维素酶与细胞壁的结合,造成多糖得率略有下降。因此,酶解时间为2.5 h左右为宜。

图4 酶解时间对多糖得率的影响Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis time on yield of polysaccharide

2.2.5 酶解温度对多糖得率的影响 由图5可知,随着酶解温度的增加,多糖得率先增加后减少,当酶解温度为50 ℃时,多糖得率最大。可能是因为纤维素酶的最适温度为50 ℃,可以最大程度的水解细胞壁,使胞内多糖溶出,低于或者高于此温度酶的活性都降低,细胞壁未被水解完全。但不同酶解温度下的多糖得率无显著差异(p<0.05),综合考虑节能和产出经济因素,选择酶解温度为40 ℃,且该因素不作为响应面优化因素。

图5 酶解温度对多糖得率的影响Fig.5 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on yield of polysaccharide

2.3 响应面实验结果及数据分析

2.3.1 响应面实验方案及结果 根据单因素实验结果,不同的pH和酶解温度对多糖得率无显著性影响,因此选择在pH为5.5、酶解温度为40 ℃时,以酶添加量(A)、液料比(B)、酶解时间(C)为自变量,多糖得率(Y)为响应值,根据Box-Behnken设计进行响应面分析实验,共17组,根据Box-Behnken设计进行响应面分析实验,实验方案及实验结果见表3。

表3 响应面分析方案及实验结果

表4 回归方程方差分析表

注:*p<0.05,代表显著,**p<0.01,代表非常显著。 运用Design-expert 8.0.6软件对表3数据进行ANOVA分析,分析结果见表4,得到二次多元回归方程:Y=22.77+0.46A+0.47B+0.22C+0.19AB+0.25AC-0.12BC-0.82A2-1.43B2-1.17C2。

由表4可知,该模型回归显著,失拟项不显著,无失拟因素存在,该模型相关系数R2为0.9522,校正决定系数R2(adj)为0.8907>0.80,变异系数CV=1.94%,模型拟合程度较好,因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析[18]。

由回归方程的显著性结果可以看出,酶添加量(A)、液料比(B)对响应值有影响,各因素的二次方对实验结果有显著影响,表明各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,各因素间的交互作用对响应值无显著影响。各因素的F值可以反映因素对实验指标的重要性,F值越大,表明对实验指标的影响越大,即重要性越大[19],从方差分析表可知,各因素对多糖得率影响的强弱次序为:A(酶添加量)>B(液料比)>C(酶解时间)。

2.3.2 响应面分析 根据回归方程,作出响应面和等高线,考察拟合响应面的形状,分析酶添加量、液料比、提取时间对多糖得率的影响。各因素及其相互作用对相应值的影响可以通过各图直观反应出来。Design-Expert 8.0.6软件处理后三维响应面和等高线图见图6～图8。

图6 酶添加量、液料比的响应面图Fig.6 Response surface plot for interactive effect of enzymatic addition and liquid/solid ratio on the yield of polysaccharide

图7 酶添加量、酶解时间的响应面图Fig.7 Response surface plot for interactive effect of enzymatic addition and enzymatic hydrolysis time on the yield of polysaccharide

图6～8直观的反映了各因素间的交互作用,各曲面都存在最高点,即在所选范围内存在最大值,说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。因此,由图可知,酶添加量和液料比对多糖得率有影响,表现为曲面陡峭,且随着数值的增加或减少,响应值有较大变化;各因素的交互作用不显著,它们对响应值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化,这也与方差分析表结果一致。

2.3.3 提取工艺条件的验证 通过Design-Expert8.0.6软件对非线性回归方程进行求解,得出理论最优三因素的条件为酶添加量1.3%、液料比41.8 mL/g、提取时间2.56 h。但考虑到实际操作的可操作性,将提取工艺修正为酶添加量1.3%、液料比42 mL/g、提取时间2.5 h。在此条件下,连续进行了3次实验,绣球菌多糖得率为(22.90%±0.26%),与预测值22.92%接近,说明该方程与实际情况拟合良好。经该方法所得多糖产量优于热水浸提法(多糖得率为9.90%)[8],是一种高效经济的提取工艺。

3 结论

本研究用单一纤维素酶法提取绣球菌多糖,通过单因素实验和响应面实验,确定最佳提取工艺为:酶添加量1.3%、液料比42 mL/g、酶解时间2.5 h、pH5.5、酶解温度40 ℃,多糖得率可达22.90%±0.26%,提高了绣球菌多糖的得率。活性多糖经提取纯化后可作为功能性食品的原料,也可开展功能活性研究,为绣球菌的深层次开发利用提供理论依据。

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Optimization of cellulase extraction ofSparassiscrispapolysaccharides using response surface methodology

JIANG Meng-ru1,WANG Xi-chang2,HU Xiao-qian3,TAO Ning-ping1,*

(College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201503,China)

In order to get higher extraction efficiency,the polysaccharides fromSparassiscrispawere extracted using cellulase. A single-factor study was designed to investigate the effects of different factors on the yield of polysarccharides,such as enzymatic addition,enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time,liquid/material ratio and pH value. Based on the results of single-factor assay,several factors were chosen to be further optimized by response surface methodology. The optimal process parameters were shown as following:pH5.5,extraction temperature of 40 ℃,enzymatic addition of 1.3%,hydrolysis time of 2.5 hours,and the liquid/solid ratio of 42 mL/g. Under these above conditions,the content of polysaccharides could be up to 22.90%±0.26%.

Sparassiscrispa;polysaccharide;cellulase;response surface experiments

2016-03-04

蒋孟如(1991-),女,硕士研究生,研究方向:食品营养与品质评价,E-mali:1551330742@qq.com。

*通讯作者:陶宁萍(1968-),女,博士,教授,研究方向:食品营养与品质评价,E-mali:nptao@shou.edu.cn。

国家科技支撑计划(2015BAD17B01)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000