核桃青皮中萘醌类色素的提取及稳定性研究

程 茹,严 成,何 微,唐周刚,唐蜀智

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.盐亭县金土地农业发展有限公司,四川绵阳 621010)



核桃青皮中萘醌类色素的提取及稳定性研究

程 茹,严 成,何 微,唐周刚,唐蜀智

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.盐亭县金土地农业发展有限公司,四川绵阳 621010)

为提高核桃青皮中萘醌类色素的提取率,在酶添加量、超声温度、超声时间、液料比4个单因素实验的基础上,采用响应面法优化酶辅助超声波提取萘醌类色素的工艺条件,并研究了光照、温度、氧化还原剂、金属离子对色素稳定性的影响。结果表明:在酶添加量1.0%,超声时间90 min,超声温度70 ℃,液料比72∶1(mL/g)的条件下核桃青皮萘醌类色素提取率最高,可达8.22%,与模型预测值相对误差为0.13%。稳定性实验结果表明,核桃青皮萘醌类色素0～7 d内具有良好的耐光、抗氧化还原和储藏性,80 ℃内热稳定性良好,Mg2+、Ca2+、Na+、K+对色素无明显作用,Al3+、Zn2+、Fe3+对该色素具有一定的增色作用,其中Fe3+作用最明显。超声波结合酶法提取工艺简单、高效、可行,提取的萘醌类色素具有较好的稳定性。

核桃青皮,萘醌类色素,超声波提取,稳定性

近年来,我国核桃种植面积和产量均居世界第一,占全球总量的40%～45%左右[1-2],且面积以每年10%的速度增长[3]。青皮作为副产物,产量一般都高于核桃,萘醌类色素是青皮色素的主要成分,具有抗霉、抗菌、抗肿瘤活性[4-6],是一类潜在的天然染料[7],且其衍生物也可用于医药和化妆品[8-9]。

萘醌类色素常用提取方法有溶剂提取法、碱提酸沉法、水蒸气蒸馏法,超声波法等。含量测定方法有HPLC法和比色法。与其他提取方法相比,超声波提取技术具有能耗低、不破坏有效成分、率效高等优点[10-11]。比色法较HPLC更加快速、简便。辛国松[12]等采用比色法测定核桃青皮中的羟基萘醌含量,发现其含量随着储藏年限的延长而降低,第一年为0.0141%,第三年降至0.007%。侯栋[13]等建立的HPLC法测定新鲜核桃青皮中5-羟基-1,4-萘醌的含量为1.66 mg/g。徐敏慧[14]等用微波辅助法提取核桃青皮中的5-羟基-1,4-萘醌,用正交实验法优化得最高含量为1.71 mg/g。以上研究所得核桃青皮萘醌含量间存在不同差异,且均偏低,主要原因除了原料差异外,作者均未能采用优于正交实验法的响应曲面法对提取工艺进行充分优化,且提取方法单一,未能与酶法结合,故导致所得含量偏低,同时也未对萘醌色素的稳定性做进一步研究。而国外对核桃青皮中萘醌类色素的提取及稳定性的相关研究鲜有报道。目前,核桃青皮因未得到合理开发利用而被大量丢弃,造成巨大的资源浪费和环境污染[15-16]。因此,对核桃青皮中萘醌类色素性质进行研究将对综合利用核桃青皮资源具有较大的社会效益、生态效益和和经济效益。

本文拟通过纤维素酶辅助超声波提取核桃青皮中的萘醌类色素,通过前期文献调研以及结合系列定性实验证明本实验采用的核桃青皮含萘醌类色素,并根据其在碱液中发生颜色改变这一特性,采用比色法测定其提取率,响应面法进一步优化提取工艺,并对其稳定性进行研究,旨在为核桃青皮资源的综合利用提供理论依据和简单易行的萘醌色素提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“棉核1号”核桃青皮 盐亭县金土地农林发展有限公司;核桃醌标准品(质量分数为97%)、纤维素酶(30U/mg)美国sigma公司;无水乙醇、氢氧化钾、双氧水、亚硫酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、氯化铁、氯化钠、氯化剂、氯化镁、硫酸铝、硫酸锌等 均为国产分析纯。

UV-3150型紫外/可见分光光度计 日本岛津;KH3200E型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制及吸收波长的确定 参照文献[12,17]并做相应修改。精确称取经105 ℃干燥至恒重的核桃醌标准品5.0 mg,60%乙醇定容至10 mL,摇匀,得标准品储备液。

准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准品储备液于25 mL比色管中,移取1 mL 5% KOH显色,加60%乙醇溶液定容至刻度;移取5% KOH置于25 mL比色管中,加60%乙醇至刻度,作为空白对照,在200～800 nm波长范围进行光谱扫描,选择检测波长为530 nm,读取不同浓度标准品在检测波长处的吸光值;最后绘制吸光值(A)与核桃醌质量浓度(ρ)的标准曲线,得回归方程Y=5X+0.0466(R2=0.9991)。

1.2.2 核桃青皮萘醌类色素的提取 参照高晓霞等[17-19]的方法,称取1.0 g核桃青皮粉,按一定液料比加入60%乙醇和一定量的纤维素酶,在一定温度和时间下酶解,灭酶,离心抽滤,滤液定容至60 mL,取2 mL样品液至25 mL比色管中,与对照品溶液同法显色,530 nm处测吸光值。萘醌类色素质量浓度根据回归曲线方程计算,萘醌类色素提取率根据以下公式计算[20]:

式中:ρ是测定用液中萘醌类色素的质量浓度(g/L);V0是样品提取液定容总体积(L);V1是量取提取液样品测定定容的体积(L);V2为测定用样液体积(L);m青皮粉的质量(g)。

1.2.3 单因素实验 分别以酶添加量(0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6%)、超声提取时间(60、90、120、150、180min)、超声提取温度(30、40、50、60、70 ℃)、液料比(40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1(mL/g))进行单因素实验,在固定单因素条件为酶添加量为1.2%、超声时间为120min、超声温度为 60 ℃的条件下分别考察各因素对萘醌类色素提取率的影响。

1.2.4 提取工艺响应面实验优化 以核桃青皮中萘醌类色素提取率为指标,在单因素实验基础上,建立4因素3水平Box-Behnken中心组合实验,因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.2.5 核桃青皮中萘醌类色素稳定性实验

1.2.5.1 温度对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 将青皮色素提取液分别在室温、40、60、80、100 ℃条件先密封保温,每隔1 h,测定吸光值。

1.2.5.2 光照对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 将青皮色素提取液分别在自然光、紫外光、三基色光、避光条件下密封观察7 d,每天定时测定吸光值。

1.2.5.3 氧化剂和还原剂对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 分别配制质量分数为0.5、1、2、3、4、5、6%亚硫酸钠的色素提取液和体积分数为0.5、1、2、3、4、5、6%的双氧水的色素提取液,以不加亚硫酸钠和双氧水的色素提取液做参比,分别在避光、自然光条件下观察7 d,每天定时测定吸光值。

1.2.5.4 金属离子对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 分别配制含有摩尔浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+的色素提取液,以相应浓度的各种离子的水溶液做空白,以不加金属离子的样品提取液做对照,观察7 d,每天定时测定吸光值[17,21]。

1.2.6 数据分析 每个样品设3个平行,应用统计软件SPSS 13.0、Origin8.5、Design-Expert 8.0.6.1进行数据处理和分析,最小二乘法进行统计分析,模型为:Y=β0+βiXi+βiiXii+βijXiXj,其中β0,βi,βii,βij为回归系数;Xi,Xj为自变量;Y为响应变量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择

将标准品溶液用紫外-可见分光光度计在200～800 nm波长范围内进行扫描,得可见光区最大吸收波长为530 nm(图1),故选530 nm为测定核桃青皮中萘醌类色素吸光值的检测波长。

图1 核桃醌标准品储备液最大吸收波长扫描图Fig.1 Absorption spectrum of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone

2.2 单因素实验结果

2.2.1 纤维素酶添加量对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响 由图2可知,在固定时间60 min,温度60 ℃,液料比60∶1的条件下,酶添加量在1.2%以内,核桃青皮中萘醌类色素提取率随着酶添加量的增加而大幅度增加,当酶添加量超过1.2%后,核桃青皮中萘醌类色素提取率随着酶添加量的增加而趋于平缓,说明酶解程度已趋于完全,故选酶添加量1.2%。同时,由图可知,酶添加量为0、1.2%时,核桃青皮中萘醌类色素提取率分别为3.21%、4.54%,即纤维素酶的添加至少将核桃青皮中萘醌类色素提取率提高了1.32个百分点,说明纤维素酶在60%乙醇溶剂中可保持有效活性,可用于提高核桃青皮中萘醌类色素的提取率。

图2 纤维素酶添加量对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响Fig.2 Effect of cellulase dosage on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.2 超声时间对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响 在固定酶添加量1.2%,温度60 ℃,液料比60∶1的条件下,由图3可知,120 min的提取时间内,随着酶解时间的延长,核桃青皮中萘醌类色素提取率呈快速上升趋势。120 min以后,随提取时间的延长,核桃青皮中萘醌类色素提取率增加缓慢,主要是因为酶的作用充分。综合考虑经济效益,故选120 min酶解时间为宜。

灰色系统理论的基本思想是：客观系统是有整体功能的，无论其现象多么复杂，数据多么乱，必然蕴涵某种内在规律。可见，灰色系统理论是一种从数据中挖掘数据规律的理论体系。式(1)揭示了输电线路的覆冰规律，通过对式(1)未知参数的预测，可以预测未来输电线路覆冰增长规律。

图3 超声时间对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.3 超声温度对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响 在固定酶添加量1.2%,时间120 min,液料比60∶1的条件下,由图4可知,随着温度的升高,核桃青皮中萘醌类色素提取率呈先上升后下降的趋势,30～40 ℃,核桃青皮中萘醌类色素提取率变化不明显,可能是因为温度过低,酶的活性较低,40 ℃以后核桃青皮中萘醌类色素提取率快速上升,60 ℃时达到峰值为7.93%。继续升高温度,萘醌类色素提取率开始下降,说明当温度升高到一程度时,酶蛋白开始变性,使酶的活性降低,从而降低了萘醌类色素的提取率[22]。因此拟确定最佳酶解温度应约为60 ℃。

图4 超声温度对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.2.4 液料比对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响 由图5可知,在固定酶添加量1.2%,时间120 min,温度60 ℃的条件下,当液料比在70∶1以内时,随着液料比的增加核桃青皮中萘醌类色素提取率增加较快,主要是因为随着溶剂中溶质浓度差的增大[23],萘醌类色素的溶解量也在增大,当液料比达70∶1以后,核桃青皮中萘醌类色素提取率快速下降,主要是因为溶液浓度增大,稀释了酶底物的浓度,故选70∶1为最佳液料比。

图5 液料比对核桃青皮萘醌类色素提取率的影响Fig.5 Effect of liquid/solid ratio on extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.3 响应面实验结果及数据分析

2.3.1 响应面实验方案设计及结果 具体结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果

2.3.2 回归方程拟合及方差分析对各因素进行回归拟合得回归方程为:Y=7.65+0.004A+0.038B+0.57C+0.14D+0.28AB+0.00725AC+0.012AD-0.17BC-0.085BD-0.13CD-0.085A2-0.19B2-0.12C2-0.19D2。

利用Design-Expert 8.0.6.1软件分析得最佳工艺条件为:酶添加量1.01%,超声时间90 min,超声温度70 ℃,液料比72.08∶1(mL/g),此条件下,核桃青皮萘醌类色素提取率为8.23%。修正实验条件为:酶添加量为1.0%,超声时间为90 min,超声温度为70 ℃,液料比为72∶1(mL/g),验证实验得核桃青皮中萘醌类色素提取率为8.22%,与理论预测值相比,其相对误差为0.13%,说明该模型能较好的预测实际提取率。

表3 回归模型及差分析

图6 两因素的交互作用对核桃青皮中萘醌类色素提取率的响应面图Fig.6 Response surface plots of variable parameters on the extraction yield of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

注:**p<0.01为极显著;*p<0.05为显著。2.4 稳定性实验结果

2.4.1 温度对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 由图7可知,在室温、40、60、80、100 ℃保温5 h的过滤后的样品液,在80 ℃范围内的吸光度随着保温时间的延长,吸光值均在0～0.02范围内波动,变化不大,而在100 ℃条件下,随着保温时间的延长,吸光值逐渐升高,在保温4 h时稳定到0.46,比0 h时增大了0.08,可能是因为温度过高,色素被氧化导致吸光值升高。故该色素在80 ℃范围内热稳定性良好。

图9 不同光照条件下不同剂量的氧化剂和还原剂对萘醌类色素稳定性的影响Fig.9 Effect of different addition amount of oxidation and reducation under the different illuminations on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

图7 温度对核桃青皮萘醌类色素稳定性的影响Fig.7 Effect of temperature on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.4.2 光照对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 由图8可知,不同光照下样品液随着放置时间的延长,吸光值均略有下降,整体在0～0.05范围内波动,说明不同光源对色素稳定性影响较小,其中紫外光照射下吸光值下降相对较快,是因为紫外光中臭氧的强氧化作用对萘醌类色素的稳定性产生了一定的破坏[27],故应尽量避免紫外光照射。

图8 光照对核桃青皮萘醌类色素稳定性的影响Fig.8 Effect of illuminations on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husks

2.4.3 氧化剂和还原剂对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 由图9可知,对照组在不同光源下0～7 d内吸光值基本无波动,此结果与2.4.1和2.4.2中结果一致。与对照组相比,样品组加入不同量的双氧水和亚硫酸钠后,吸光值在0～7 d内基本稳定,在0～0.05范围内波动,总体和对照组值接近,说明常温密封状态下色素提取液在不同光照、时间、氧化剂和还原剂作用下比较稳定,在氧化剂或者还原剂及光照协同作用下不易被氧化或者还原。

2.4.4 金属离子对核桃青皮中萘醌类色素稳定性的影响 由图10可知,Fe3+、Zn2+、Al3+对吸光值具有促进作用,其中Fe3+作用最明显,且随着离子浓度的增加而增加,总体吸光值绝对值均在0～0.03范围内逐渐增加,Mg2+、Ca2+、Na+、K+对吸光值无明显作用,可能因为Al3+、Zn2+和Fe3+与色素中含α-OH或邻二酚OH结构的物质结合成有色络合物而起到增色的作用。

图10 金属离子对核桃青皮萘醌类色素的影响Fig.10 Effect of metal ions on the stability of naphthoquinones quinones pigments from walnut green husk

3 结论

采用响应面法对核桃青皮萘醌类色素的提取条件进行优化,建立了萘醌类色素提取率的回归模型,得出酶法辅助超声提取核桃青皮萘醌类色素的最佳组合为:酶添加量1.0%,超声时间90 min,超声温度70 ℃,液料比72∶1,核桃青皮中萘醌类色素提取率达8.22%,与模型预测值8.23%接近,进一步验证了该模型的可靠性,各因素对核桃青皮萘醌类色素提取率影响显著性顺序依次为超声温度>液料比>超声时间>酶添加量;稳定性研究结果表明,核桃青皮萘醌类色素在0～7 d内具有较好的耐光、抗氧化还原、贮藏性,80 ℃范围内热稳定性良好,Mg2+、Ca2+、Na+、K+对色素无明显作用,Al3+、Zn2+、Fe3+对该色素具有一定的增色作用,其中Fe3+作用最明显。综上,响应面法优化酶法辅助超声波提取核桃青皮萘醌类色素的工艺简单,可行,所提取的萘醌类色素具有良好的稳定性。

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Extraction and stabilities of naphthoquinones pigments from walnut green husks

CHENG Ru1,YAN Cheng1,*,HE Wei1,TANG Zhou-gang2,TANG Shu-zhi2

(1.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2.Yanting Golden Land of Agriculture and Forestry Development Co.,Ltd,Mianyang 621010,China)

The enzymatic-assisted ultrasound-extraction of naphthoquinones pigments from walnut green husks was optimized using response surface methodology. The effects of several operating parameters,namely enzyme dosage,ultrasonic time,ultrasonic temperature,liquid/solid ratio,on the yield of naphthoquinones pigments from walnut green husks were studied. The effects of illuminations,temperature,oxidants,reducing agent,metal ions on the pigments stabilities were also studied. Results indicated that the highest yield of naphthoquinones pigments of 8.22% was achieved when the extraction was carried out with enzyme added amount of 1.0%,ultrasonic time for 90 min,ultrasonic temperature of 70 ℃,ratio of liquid-solid 72∶1(mL/g),which was 0.13% of relative error compared with the predicted value. Stabilities tests showed that naphthoquinones pigments from walnut green husks had better lightfastness,anti-oxidation-reduction,storage tolerance in the range of 0～7 days and thermotolerance in the range of 80 ℃. Metal ions Al3+、Zn2+、Fe3+had a certain hyperchromic effect for pigments,and Fe3+’shyperchromic effect was the most significant. There was no effect of Mg2+、Ca2+、Na+、K+on the pigments. The ultrasonic bonding enzymatic extraction technology was simple,viable,and the extracted pigments had better stability.

walnut green husk;naphthoquinones pigments;ultrasonic extraction;stability

2016-05-04

程茹(1990-),女,在读硕士研究生,研究方向:食品化学工程,E-mail:cr20103257@163.com。

*通讯作者:严成(1963-),男,硕士,教授,研究方向:食品化学与功能性食品,E-mail:ycx824511@163.com。

四川省科技创新苗子工程资助项目(2016088)。

TS209

B

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000