壳聚糖与果胶复合作用研究及显微观察

张立彦,刘小芳,李作为

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640;2.广东轻工职业技术学院,食品与生物工程系,广东广州 510300)



壳聚糖与果胶复合作用研究及显微观察

张立彦,刘小芳,李作为

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640;2.广东轻工职业技术学院,食品与生物工程系,广东广州 510300)

探讨了壳聚糖和果胶特性、加量配比、溶液pH及聚合物浓度对壳聚糖与果胶复合溶液浊度、ζ-电位的影响,并结合观察复合物的显微状态研究其影响机制及壳聚糖/果胶的静电复合过程。结果表明,适当分子量的壳聚糖(15万)更易与果胶形成大颗粒的复合物,壳聚糖脱乙酰度对溶液浊度的影响不大;高酯果胶易与壳聚糖形成结构紧密的复合物;随果胶加量升高,复合物显微结构从松散、稀疏变为致密,溶液浊度也呈现4阶段变化;当果胶加量在82%(w/w)左右时复合物颗粒ζ-电位为0,但对应的溶液浊度并不是最高;壳聚糖及果胶在溶液pH3.0～4.0之间最易发生静电复合并形成结构均匀、细密的复合物,溶液浊度也较高;由于聚合物浓度影响了分子链的伸展及静电复合,使得复合物结构明显不同。

壳聚糖,果胶,静电复合,显微观察

目前,虽然已有关于壳聚糖/果胶复合条件的探索以及形成的PEC特性(pH敏感性、溶胀特性及药物释放特性)研究[7-8,12],但缺乏对各条件影响作用的深入探讨,因此对壳聚糖与果胶的复合作用机制或过程仍知之甚少,直接影响了PEC的制备和应用。鉴于此,本文针对壳聚糖/果胶PEC制备过程中各条件对复合物溶液浊度、ζ-电位等的影响,结合显微观察,深入探讨其影响作用,以期为壳聚糖/果胶PEC的制备和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高酯果胶 Sigma-Aldrich公司,P9135-100G,分子量为4万,酯化度>74.0%;低酯果胶 衢州果胶公司,酯化度<30%,分子量为4万;壳聚糖 奥兴生物有限公司,分子量分别为5、15、25和35万(脱乙酰度大致相同),脱乙酰度分别为76.5%和83.6%(分子量大致相同);其他所有化学试剂 均为分析纯。

PHS-25型pH计 上海雷磁仪器厂;752型紫外-可见分光光度计 上海现科分光仪器有限公司;Nano-ZS MPT-2电位仪 英国马尔文公司;CX31型电子显微镜 奥林巴斯(广州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖/果胶复合溶液的制备及测定

1.2.1.1 壳聚糖、果胶特性对溶液复合的影响 常温下进行。分别配制0.5%、pH4.0的壳聚糖(分子量分别为5、15、25和35万及脱乙酰度为76.5%和83.6%的6种壳聚糖)和果胶酸性溶液,并缓慢搅拌过夜。取2 mL壳聚糖溶液置于小烧杯中,边搅拌边滴加入不同体积的果胶溶液,壳聚糖溶液始终保持2 mL不变,按壳聚糖∶果胶体积比=2∶0、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入果胶溶液(对应的果胶加量分别为0、9.1%、11.1%、14.3%、20%、25%、33.3%、50%、66.7%、80%、85.7%、88.9%、90.9%、92.3%、93.3%、94.1%、100%,文中果胶的加量是指果胶质量占壳聚糖、果胶总质量之和的百分比),使之与壳聚糖溶液通过复凝聚法形成壳聚糖/果胶复合溶液,加入果胶溶液之前补充一定体积pH4.0的醋酸缓冲液,使复合溶液最终体积达到20 mL,混匀后放置24 h使充分复合,之后测定壳聚糖分子量和脱乙酰度、果胶酯化度及其加量对壳聚糖/果胶复合溶液浊度、ζ-电位及显微结构的影响,并根据结果选择适宜的条件。

1.2.1.2 pH对溶液复合的影响 根据前续实验结果,选用壳聚糖分子量15万、高酯果胶(加量为80%)进行pH对壳聚糖/果胶复合溶液影响的实验,对不同pH条件、浓度为0.5%的壳聚糖和果胶溶液进行复合,对壳聚糖/果胶复合溶液的浊度、ζ-电位及显微结构进行测定与观察。

1.2.1.3 浓度对溶液复合的影响 选用壳聚糖分子量15万、高酯果胶(加量80%)、pH3.5进行壳聚糖及果胶浓度对复合物溶液影响的实验,对不同浓度(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)条件下壳聚糖/果胶复合溶液的浊度及显微结构进行测定和观察。

1.2.2 浊度的测定 样品在测定浊度前需用高速涡旋仪振动、混匀10 s,以使混合均匀,然后于420 nm处测定不同配比壳聚糖/果胶复合溶液透光度的变化,并按以下公式计算浊度。

浊度的计算公式如下:

其中,L为光程长度(cm),It为投射光强度,I0为入射光的强度。

1.2.3 ζ-电位的测定 将由1.2.1制备得到的不同配比的壳聚糖/果胶复合溶液稀释10倍,用漩涡振荡器充分震荡(5～10 s)后,用注射器吸取1 mL样品注射到弯曲式毛细管样品池,注意避免有气泡,采用标准操作程序(SOP)进行测量,每个样至少测定2次。

1.2.4 显微观察 采用光学显微镜观察并拍照溶液中复合物的状态。用滴管吸取1滴混匀的样品,置于载玻片上,再将盖玻片轻放于样品上,并在40倍下观察,选择复合物中最具代表性的片段进行拍照。

1.2.5 数据分析 每组进行三次平行实验,使用Office 2007中的Excel软件进行图表整理与数据分析。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖、果胶特性及配比对复合液的影响

图1 壳聚糖分子量、果胶加量及其酯化度对复合物溶液浊度的影响Fig.1 The influence of chitosan molecular weight volume,pectin content and the esterification degree on the compound solution turbidity

从图1还可以看出,当壳聚糖的加量一定时,随着果胶加入量增加,溶液浊度发生四个阶段的变化:在果胶加量为0～20%(w/w)时,溶液浊度随果胶加量的增加变化缓慢;当果胶加量在20%～85%时,溶液浊度随果胶加量线性增加;当果胶加量在85%～93.3%左右时,溶液浊度急剧上升,表明此加量范围内大颗粒复合物大量形成;而当果胶加量>93.3%后,溶液浊度则稍有下降,说明复合物粒度下降,对光的散射能力减弱[14]。出现上述变化可能是由于壳聚糖与不同浓度果胶形成的复合物结构不同,对光的散射性质不同,导致宏观性质(浊度)产生差异。

图2 壳聚糖脱乙酰度对复合物溶液浊度的影响Fig.2 The influence of chitosan degree on the on the compound solution turbidity

图3 果胶加量对复合物ζ-电位的影响Fig.3 The influence of pectin contenton compound solution ζ-electric potential

与图1对比可以发现,复合物溶液浊度最大时果胶的加量(93.3%)超过电中性时的(82%),此时果胶过量而复合物表面呈负电性。这可能是因为过量的果胶在壳聚糖与果胶形成的“初始”(primary)复合物颗粒表面桥连,形成更大的复合物。当果胶的量超过一定的量(>93.3%),由于PEC表面的负电性太强,致使大的颗粒发生解离,溶液浊度下降[13-15](图1)。

图4 不同果胶酯化度及加量对壳聚糖/果胶复合物微观状态的影响Fig.4 The influence of different pectin esterification and content on chitosan/pectin polymer microscopic state注:a代表加入低酯果胶,b代表加入高酯果胶;壳聚糖分子量15万,放大倍数为40倍。

2.1.4 果胶酯化度及加量对复合物显微结构的影响 由图4可知,果胶酯化度及加量不同,即壳聚糖与果胶的配比不同,所形成的复合物空间结构差别明显。当果胶加量较低(33.3%)时,显微观察到溶液中仅有微小、散乱的枝状物体,表明此时复合物少而松散,高酯果胶形成的复合物稍多,结构稍明显;当果胶加量达到66.7%后,大量复合物形成,低酯果胶形成的复合物均匀分散,而高酯果胶却与壳聚糖形成了较致密、但仍均匀的结构;当果胶加量达到85.7%后,虽然低酯果胶形成的复合物仍相对均匀,但有些部位开始出现较致密的线状结构,高酯果胶形成的复合物更致密些,说明此时两种聚合物分子结合紧密;果胶加量进一步提高到90.9%,复合物结构变得清疏,尤其是高酯果胶与壳聚糖形成的复合物呈现出明显的线状结构,果胶的毛发状侧链伸展,带有一定的刚性,这可能是由于果胶过量,复合物带负电荷,分子链上的静电斥力使得复合物链状结构伸展,刚性增强,而低酯果胶形成的复合物结构则较弯曲柔顺;当果胶加量增加到93.3%后,复合物线状结构明显,且尽量伸展,尤其是高酯果胶参与形成的复合物结构缠结,链段粗厚,表现出更强的刚性和张力;当果胶加量达到94.1%后,复合物主链变细,且相互分离,说明链段之间的静电斥力作用非常强,使得复合物分子离散。

结合复合物浊度、ζ-电位随壳聚糖/果胶配比的变化以及复合物的微观结构(图1、图3、图4),可以阐述壳聚糖与果胶的复合过程如下:在果胶加量较少时(<20%),少量的果胶分子通过-COO--+H3N静电作用分散结合在壳聚糖长链上,复合物粒子非常小,结构松散,量也较少,所以溶液浊度较低;随着果胶加量增加,复合物形成的量越来越多,粒度逐渐增加,对光的散射能力增强,溶液浊度逐渐增加,直至达到静电平衡(ζ-电位为0,果胶加量82%左右),此时复合物颗粒内部结构较均匀、致密;其后,随着果胶加量增加,过量的果胶将已形成的复合物通过桥连,形成更粗、更长、更复杂的复合物;当果胶的量超过93%后,复合物链段之间的静电斥力作用强,复合物分子离散,与图1中的浊度下降相对应。

2.2 溶液pH对壳聚糖与果胶复合作用的影响

2.2.1 pH对溶液浊度的影响 由图5可知,pH对复合物溶液的浊度有显著影响。溶液pH为2.0时,溶液近乎透明,浊度较低;溶液pH为3.5时,复合物溶液的浊度最高,在pH4.5降至较低点,之后溶液浊度又开始逐渐上升。由于壳聚糖、果胶自身pKa值的差异,复合环境pH的变化主要影响了壳聚糖和果胶的带电性及分子蜷曲度,造成复合位点变化,从而影响壳聚糖/果胶复合物的复合程[17]。

图5 pH对壳聚糖与果胶复合物溶液浊度的影响Fig.5 The influence of pH on chitosan/pectin polymer solution turbidity

2.2.2 溶液pH对复合物电位的影响 由图6可知,随着溶液pH由2逐渐变化到6,复合物表面的ζ-电位由正逐渐变负,表明正电荷逐渐减少,而负电荷数量增多,这是由于聚合物在不同pH条件下解离形成的带电基团数量不同,造成复合物总的表面电荷变化。Espinosa-Andrews指出当pH调整到两胶体中带相反电荷分子等量时,即为复合物复聚最佳的pH条件,因为此时盐键的数量最多[16]。由图6数据可知,壳聚糖与果胶形成复合物的最佳pH为3.0～3.5左右。

图6 pH对壳聚糖/果胶复合物ζ-电位的影响Fig.6 Influence of pH on ζ-electric potential of chitosan/pectin complex

图7 不同pH溶液中壳聚糖/果胶复合物的显微照片(40×)Fig.7 The micrograph of chitosan/pectin polymer in different pH solution(40×)

2.3 壳聚糖、果胶浓度对复合作用的影响

2.3.1 壳聚糖、果胶浓度对复合物溶液浊度的影响 由图8可见,壳聚糖和果胶浓度对溶液浊度也有显著影响。当聚合物浓度为0.1%时,溶液浊度仅为0.5左右;其后,随着浓度提高至0.5%,溶液浊度急升至2.244±0.085 cm-1;当浓度为1%后,溶液浊度继续升高至3.0 cm-1左右,但浓度再增大浊度变化不大。

图8 聚合物浓度对溶液浊度的影响Fig.8 The influence of polymer solution concentration on turbidity

图9 不同聚合物浓度下复合物的显微状态Fig.9 The microscopic state of different polymer concentration

2.3.2 聚合物浓度对复合物显微状态的影响 观察图9中各显微照片可以发现,聚合物浓度对复合物的结构有很大影响:当两聚合物浓度为0.1%时,形成的复合物结构松散,对光的散射能力很弱;当浓度为0.5%时,复合物自然卷曲,结构均匀,没有明显的链状结构;当浓度达到1%～1.5%后,复合物呈现明显的粗链型结构,分子伸展,表现出较强的分子刚性;当浓度达到2.0%后,复合物结构发生明显变化,分子链卷曲,较松散,分子刚性小。因为聚合物浓度相对高时(2.0%),大分子的解离度低,骨架柔韧性高[12],所以复合物结构松散、卷曲。

4 结论

壳聚糖分子量太小或太大都不利于与果胶的复合作用,15万时复合溶液浊度最高,壳聚糖脱乙酰度对静电复合作用影响不显著,与果胶的加量有关。

高酯果胶更易与壳聚糖形成结构紧密的复合物,溶液浊度较高;随着果胶加量增加,复合物溶液浊度发生四个阶段的变化;果胶加量在82%时颗粒表面的ζ-电位为0,果胶加量在85%～93%时,溶液的浊度增加最快,复合物结构呈现明显的粗链状结构,结构较致密。

溶液pH显著影响溶液浊度及复合物结构,当溶液pH在3.0～4.0之间时,复合物结构较复杂、均匀,溶液浊度较高。

聚合物浓度不仅影响复合物溶液浊度,还对复合物的结构有明显影响。浓度为0.1%～1%,此时复合溶液浊度呈缓慢上升趋势;浓度为1%～2%,此时溶液浊度基本保持不变。浓度较低或较高时,形成的复合物结构较松散卷曲;聚合物浓度在1%～1.5%,复合物呈现粗链型结构,分子刚性较强。

壳聚糖与果胶发生静电复合作用与聚合物分子链的伸展、弯曲及静电位点的结合、复合物表面电荷密切相关。本研究所探讨条件会影响壳聚糖及果胶的上述特性,所形成的复合物结构也发生相应变化。

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Study and microscopic observation on complexation of chitosan and pectin

ZHANG Li-yan1,LIU Xiao-fang1,LI Zuo-wei2

(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Industry Polytechnic,Department of Food and Bioengineering,Guangzhou 510300,China)

Effects of characteristics of chitosan and pectin,chitosan/pectin ratio,solution pH and polymer concentration on the turbidity and ζ-potential of solution were investigated and the affecting mechanisms,electrostatic complexation between chitosan and pectin were elaborated by combining the microstructure of complex. The results showed that chitosan with medium molecular weight(15×104)react more easily with pectin to form large complexes,while the deacetylation degree of chitosan had small effect on turbidity of complexation solution.High methoxyl pectin could form compact complexes with chitosan.With the addition level of pectin increasing,the microstructure of complexes changed from loose and sparse to more compacter,and the turbidity of solution showed 4 phases.The ζ-potential of complexation particles became 0 at pectin addition level of with 82%(w/w),but the turbidity of solution didn’t reach the maximum.When the solution pH was between 3.0 and 4.0,chitosan and pectin were easiest to interact with each other to form complexes with a even,dense structure and the solution had higher turbidity.The complexes formed by chitosan and pectin with various concentrations showed significant different structure because of the effects of polymer concentration on stretch of molecular chain and polyelectrolyte complexation.

chitosan;pectin;electrostatic complexation;microscopy

2015-12-22

张立彦(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：食物资源高值化利用研究，E-mail：liyanzh@scut.edu.cn。

华南理工大学中央高校基本科研业务费资助项目(2014ZM0070)；广东省科技计划项目(2014B020204002)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000