电针耳穴对年龄相关性听力损失豚鼠听觉中枢β-catenin表达的影响△

刘淑云 邓力强,2 杨烨 殷泽登



·实验研究·

电针耳穴对年龄相关性听力损失豚鼠听觉中枢β-catenin表达的影响△

刘淑云1邓力强1,2杨烨3殷泽登1

目的 探讨电针耳穴对D-半乳糖所致的年龄相关性听力损失豚鼠模型听觉中枢β-链蛋白(β-catenin)表达的影响。方法 取3月龄豚鼠30只，随机分成三组：D-半乳糖模型组、D-半乳糖+电针组和对照组，每组各10只；18月龄豚鼠10只作为自然老化组。D-半乳糖模型组给予D-半乳糖(300 mg·kg-1·d-1)颈背部皮下注射，每天1次，连续6周；对照组给予等量生理盐水注射相同部位、相同频次、持续相同时间；D-半乳糖+电针组给予相同剂量的D-半乳糖颈背部皮下注射，30 min后给予电针听宫穴和翳风穴治疗15分钟，每日1次，共6周。自然老化组豚鼠常规饲养。上述实验结束后采用蛋白质印迹(Western blot)方法检测四组豚鼠下丘和听皮层β-catenin蛋白的表达变化。结果 ①与对照组相比，D-半乳糖模型组和自然老化组豚鼠下丘β-catenin蛋白表达量下降；与D-半乳糖模型组相比，D-半乳糖+电针组下丘β-catenin蛋白表达量增加；②D-半乳糖模型和自然老化组豚鼠听皮层β-catenin蛋白表达量下降，D-半乳糖+电针组其表达量增加。结论 β-catenin蛋白可能通过Wnt/β-catenin信号通路，调控细胞生长、分化及凋亡，参与下丘和听皮层的老化过程；电针听宫穴和翳风穴可能通过增加下丘和听皮层β-catenin蛋白表达，经Wnt/β-catenin信号通路延缓豚鼠年龄相关性听力损失的发生。

电针； 年龄相关性听力损失； 听觉中枢； β-链蛋白

据统计，老年性聋(又称年龄相关性听力损失)的发病率约在30%～60%之间[1]，听力障碍严重影响老年人的生活质量和社会交往，因此对老年性聋的机制及防治研究具有现实意义。研究发现Wnt信号通路参与内耳多个环节，包括耳部结构、前庭器官的形成和耳蜗的发育[2]。Wnt信号通路能够诱导出生后小鼠耳蜗感觉前体细胞增殖[3]，可作为感音神经性听力损失后耳蜗植入引导轴突生长的候选通路[4]。β-catenin作为经典Wnt信号通路中最关键的信息分子，对细胞生长、分化及凋亡起着调控作用[5]；Jacques等[6]研究发现Wnt/β-catenin信号在耳蜗发育中具有调节毛细胞增殖和分化的双重作用；Ren等[7]研究显示胚鼠神经干细胞移植组的老年鼠听力阈值降低，达到改善听功能的作用。但β-catenin在年龄相关性听力损失豚鼠听觉中枢表达及电针耳穴对其表达是否有影响及作用机制尚不清楚，因此，本研究拟通过建立年龄相关性听力损失豚鼠模型，检测其下丘和听皮层β-catenin蛋白的表达并观察电针耳穴对其表达的影响，探讨β-catenin在年龄相关性听力损失发病中的作用，及电针耳穴对年龄相关性听力损失防治的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取耳廓反射灵敏、无噪声暴露及耳毒性药物使用史的3月龄杂色豚鼠30只，随机分为D-半乳糖模型组、D-半乳糖+电针组、对照组，每组10只；另选取18月龄豚鼠10只作为自然老化组。豚鼠购买于西南医科大学(原泸州医学院)实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1 年龄相关性听力损失豚鼠模型的建立 D-半乳糖模型组给予D-半乳糖(300 mg·kg-1·d-1)颈背部皮下注射，每天1次，连续6周；对照组给予等量生理盐水注射相同部位、相同频次、持续相同时间；D-半乳糖+电针组给予相同剂量的D-半乳糖颈背部皮下注射，30 min后给予电针听宫穴和翳风穴治疗15分钟，每日1次，共6周。自然老化组豚鼠常规饲养。

1.2.2 电针听宫穴和翳风穴 D-半乳糖+电针组豚鼠清醒状态下，在注射D-半乳糖30 min后，用自制装置固定，取双侧听宫穴和翳风穴[8，9]，用HM6805-I型经穴治疗仪(HM6805-I型，1100801072，四川恒明科技开发有限公司)刺激，疏密波，频率14 Hz，强度0.4～0.6 mA，连续输出，9次/秒，连续刺激15 min，每天1次，共6周。刺激强度以豚鼠针刺部位颤动、四肢轻轻抖动但不挣扎嘶叫为度[10]。

1.2.3 双侧下丘及听皮层取材及样本制备 完成上述实验(6周)后各组豚鼠麻醉下，断头、冰上取双侧下丘和听皮层，立即放入-80 ℃冰箱中保存备用。从-80 ℃冰箱中每组取出豚鼠下丘和听皮层，称重、混合、剪碎、移入匀浆器，加入裂解液(裂解母液300 μl+TBP0.3 μl+Biolyte1.5 μl)，匀浆15次，置冰上震荡裂解15 min，4 ℃，12 000 rpm离心40 min，收集上清液即为蛋白质提取物；用Bradford法测定样品的总蛋白含量。

1.2.4 Western blot法检测β-catenin蛋白表达 采用4%浓缩胶和10%分离胶分离蛋白质样品，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V；采用半干式转膜方法转膜、脱脂牛奶进行封闭、 β-catenin抗体和内参一抗(β-actin)室温孵育2小时或4 ℃过夜，二抗(anti-mouse IgG-HRP)和内参二抗(anti-rabbit IgG-HRP)室温孵育1小时。底物发光，柯达X-OMAT胶片压片，并用Quantity One软件分析条带灰度值；为避免人为因素造成的实验误差，结果采用内参(β-actin)对上样量加以校正，每组实验结果采用目的蛋白灰度值/内参灰度值的比值的相对灰度值进行比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，运用单因素方差中LSD检验方差是否齐性，SNK分析组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组豚鼠下丘β-catenin蛋白表达 与对照组相比，D-半乳糖模型组和自然老化组豚鼠下丘β-catenin蛋白表达降低(P<0.05)；与D-半乳糖模型组相比，D-半乳糖+电针组豚鼠下丘β-catenin蛋白表达增加(P<0.05)；D-半乳糖模型组和自然老化组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表1，图1)。

2.2 各组豚鼠听皮层β-catenin蛋白表达 与对照组相比，D-半乳糖模型组和自然老化组豚鼠听皮层β-catenin蛋白表达降低(P<0.05)；与D-半乳糖模型组相比，D-半乳糖+电针组豚鼠听皮层β-catenin蛋白表达增加(P<0.05)；D-半乳糖模型组和自然老化组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表1，图2)。

表1 各组豚鼠下丘及听皮层β-catenin蛋白表达相对灰度值

注：★与对照组比较，P<0.05；▲与D-半乳糖模型组比较，P<0.05

图1 各组豚鼠下丘β-catenin蛋白表达CG为对照组，EG为自然老化组，DG为D-半乳糖模型组，DEG为D-半乳糖+电针组

图2 各组豚鼠听皮层β-catenin蛋白表达CG为对照组，EG为自然老化组，DG为D-半乳糖模型组，DEG为D-半乳糖+电针组

3 讨论

3.1 β-catenin在豚鼠年龄相关性听力损失发生和发展中的作用 β-catenin作为机体组织重要的细胞黏附分子和信号转导蛋白，是经典Wnt信号通路中最关键的信息分子，对细胞生长、分化及凋亡起着调控作用。研究发现β-catenin在耳蜗毛细胞分化和再生中起作用[11，12]，斑马鱼毛细胞的再生由Wnt/β-catenin信号通路控制[13]，且H3K9me2抑制可通过下调Wnt信号通路来减少毛细胞损害的斑马鱼毛细胞再生，结果表明，H3K9me2下调通过Wnt /β-catenin 信号传导途径的失活显著降低新霉素诱导的毛细胞损伤后的毛细胞再生[14]。研究发现在老年大鼠脑中，β-catenin主要分布于室下层、皮层锥体细胞层、丘脑和海马等区域，而且阳性细胞数量和强度显著低于成年大鼠[15]，老化小鼠脑室下区β-catenin蛋白表达比青年小鼠明显降低[16]。本课题组前期研究发现D-半乳糖注射能致豚鼠ABR波III潜伏期延长，文中结果显示D-半乳糖模型组和自然老化组豚鼠下丘和听皮层β-catenin蛋白表达明显低于对照组，说明D-半乳糖可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控豚鼠下丘和听皮层细胞的再生、分化和凋亡，参与豚鼠听觉中枢老化过程，从而参与豚鼠年龄相关性听力损失的发生和发展过程。而老龄化可能会导致Wnt/β-catenin信号通路相关信号分子表达下降，增加多巴胺神经元易损性[17]。

3.2 β-catenin在电针耳穴防治豚鼠年龄相关性听力损失中的作用 针刺耳穴不仅可以通过对毛细胞和耳蜗血管纹细胞线粒体酶的活性保护，维持细胞能量代谢，保证细胞各种功能的活动，减少细胞损伤[18]，而且对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞产生保护作用[19]。Wnt/β-catenin信号通路的失活能显著降低斑马鱼毛细胞的再生[20]，且β-catenin基因突变小鼠表现为下丘畸形和中脑导水管狭窄，引起脑积水[21]；研究发现激活Wnt信号通路不仅能增加早期前体感觉细胞增殖，还能使支持细胞重新进入细胞周期并分化为毛细胞，并能调节毛细胞束的方向[22]；Jan等[23]发现 Wnt激动剂能刺激鼓膜边缘细胞增殖，而Wnt抑制剂抑制鼓膜边缘细胞增殖；Lgr5+支持细胞作为耳蜗毛细胞的祖细胞[24]，由β-catenin过度表达参与新生小鼠毛细胞的生成[25]；Li等[26]研究证实Notch抑制通过激活Wnt信号通路并促进Lgr5+祖细胞有丝分裂增加导致哺乳动物耳蜗产生毛细胞；β-catenin表达增强不仅可降低活性氧的水平，还能抑制半胱天冬酶介导的细胞凋亡，从而保护新霉素导致小鼠耳蜗毛细胞的损失，成为预防毛细胞死亡的新的治疗靶点[27]。本课题组前期研究发现电针耳穴能缩短D-半乳糖致年龄相关性听力损失豚鼠ABR波III潜伏期，但具体机制尚不清楚；本研究发现D-半乳糖+电针组豚鼠下丘和听皮层β-catenin蛋白表达明显高于D-半乳糖模型组，说明电针耳穴能够增加下丘和听皮层β-catenin蛋白表达，从而可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节听觉中枢细胞的再生、分化来改善听力，延缓年龄相关性听力损失的发生。

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(2016-05-11收稿)

(本文编辑 李翠娥)

The Effects of Electroacupuncture at Tinggong and Yifeng on β-catenin Expression in Auditory Center of Guinea Pig with Age-related Hearing Loss

Liu Shuyun*, Deng Liqiang, Yang Ye, Yin Zedeng

(*Department of Otorhinolaryngology of the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou， 646000, China)

Objective To explore the effects of the application of electroacupuncture at Tinggong and Yifeng to the β-catenin expression in auditory center of guinea pigs with age-related hearing loss (AHL) induced by D-galactose.Methods There were four groups. Thirty 3-month-old guinea pigs were randomly divided into three groups including the D-galactose group (DG,n=10), D-galactose and electroacupuncture group (DEG,n=10), and the control group (CG,n=10). The elderly group (EG) included ten 18-month-old guinea pigs. The guinea pigs in the DG had been subcutaneously injected D-galactose (300 mg·kg-1·d-1) for 6 weeks. The CG received the same dose of physiological saline as D-galactose. Moreover, the guinea pigs in the DEG were subcutaneously injected the same dose of D-galactose, and electroacupunctured at Tinggong and Yifeng for 15 minutes half an hour later. Finally, the guinea pigs in the EG were conventionally raised. The expressions of the β-catenin in the auditory center of the guinea pigs were detected by Western blots.Results There was a significant decrease of β-catenin expression in the inferior colliculus of the DG and the EG (P<0.05, compared with CG) and a significant increase in the DEG (P<0.05, compared with DG). There was a significant decrease of β-catenin expression in the auditory cortex of the DG and the EG (P<0.05, compared with CG) and a significant increase in the DEG (P<0.05, compared with DG).Conclusion Beta-catenin may participate in the aging process induced by D-galactose of the inferior colliculus and auditory cortex by regulating cell growth, differentiation and apoptosis by Wnt/beta-catenin signal pathway. Beta-catenin may play a role in inhibiting the occurrence of AHL by electroacupuncturing at Tinggong and Yifeng by Wnt/beta-catenin signal pathway.

Electroacupuncture; Age-related hearing loss; Auditory center; Beta-catenin

刘淑云，女，四川人，硕士，主要研究方向为听力与言语疾病的基础与临床。

殷泽登(Email: landao0070450@sina.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.015

时间：2016-11-2 16:18

R764.43+6

A

1006-7299(2016)06-0593-04

△ 四川省卫生厅课题(070248)和(100237)资助

1 西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科(泸州 646000)； 2 湖南省郴州市第一人民医院儿童耳鼻喉科； 3 西南医科大学基础医学院生物化学教研室

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.002.html