特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立*

张志坚 管红霞# 杨琨 肖伯奎 廖华 江洋 周涛 华清泉



·实验研究·

特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立*

张志坚1管红霞1#杨琨1肖伯奎1廖华1江洋1周涛1华清泉1

目的 建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型，为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法 成年雌性SPF级CBA/J小鼠60只，随机分为实验组和生理盐水组，每组30只，实验组动物经圆窗渗透给予10 μl哇巴因(ouabain)，生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)，并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neurons，SGNs)细胞及内耳毛细胞(hair cells，HCs)的变化。结果 ①与生理盐水组比较，实验组给药后各时间点ABR反应阈均明显升高，波Ⅰ潜伏期延长，振幅明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比，实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。④实验组在给药后不同时间点，耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论 哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA/J小鼠内耳螺旋神经元及其功能，而不损伤内、外毛细胞，是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。

哇巴因； 螺旋神经元； 感音神经性聋； 动物模型； 干细胞治疗； 小鼠

内耳毛细胞及螺旋神经元受损导致的感音神经性聋(sensorineural hearing loss, SNHL)是人类最常见的多发病之一，可导致严重的交流障碍，严重影响患者工作、学习及生活质量；因此，建立合适的感音神经性聋动物模型，对研究耳聋及其治疗具有十分重要的意义[1]。传统动物造模多选用氨基糖苷、顺铂、庆大霉素类等药物经肌肉或腹腔注射诱导其内耳感觉细胞的损伤，但这种造模方式不仅损伤耳蜗结构，且因其有全身毒性还可能损伤其他组织或器官。哇巴因(ouabain)是一种Na+-K+-ATP酶抑制剂，可抑制耳蜗螺旋神经节、螺旋缘、毛细胞和血管纹的Na+-K+-ATP酶，有效阻断其离子转运而降低内淋巴电位，从而损伤内耳，造成感音神经性聋[2～5]。

本研究拟通过使用ouabain经小鼠内耳圆窗渗透给药，并在给药后动态观察ouabain对小鼠听功能、内耳毛细胞及螺旋神经元的影响，建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型，探讨该方法用于内耳螺旋神经元损伤动物模型造模的可行性，为进一步研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选择北京华阜康公司提供的成年雌性SPF级的CBA/J小鼠(8～10周龄，体重22～25克)60 只，其外耳形态及耳廓发射正常，所有小鼠均常规饲养于武汉大学第一临床学院实验动物中心。将实验动物随机分为实验组及对照组，每组30只小鼠；各组按给药后时间再分为7、14和30天组，每组10只小鼠。

1.2 内耳螺旋神经节损伤小鼠造模 两组小鼠完成术前听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)测试后，所有动物均以右耳为手术耳。实验组小鼠麻醉后，使用动物剃毛刀剃除小鼠术耳后的毛发，将小鼠头部固定，75%酒精消毒术野皮肤，切开小鼠耳后皮肤，在解剖显微镜的直视下钝性分离皮下脂肪及肌肉，充分暴露听泡；用鼓膜切开刀于听泡下方挑开听泡，暴露耳蜗底回、圆窗龛及镫骨动脉等解剖标志；用微量注射器将10 μl ouabain溶液分次注入圆窗龛，切勿刺破圆窗膜；在60分钟内完成给药，给药过程避光操作。对照组以生理盐水代替ouabain溶液，余步骤相同。给药完成后用棉球蘸干术腔的液体，以薄层骨蜡封闭听泡，仔细检查术腔有无出血，关闭术腔，缝合皮肤；待其清醒后放回饲养笼中。注意术中、术后保温及术后营养支持。

1.3 ABR及DPOAE测试 两组动物分别于给药前及给药后7、14、30天检测ABR、DPOAE。以1% 戊巴比妥钠按(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，使用Tucker Davis Technologies equipment III (TDT, USA) 行听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)检测。在隔声屏蔽室内，将麻醉好的实验小鼠置于37 ℃的热水袋上。ABR检测：记录电极置于两外耳道连线中点处的头皮下，参考电极置于检测耳乳突皮下，接地电极置于对侧耳乳突皮下，声源置于检测耳外耳道口水平的1.0 cm处，click短声刺激，持续时间100 ms，刺激频率为21.1次/秒，叠加次数为1 024次；低通滤波为50 Hz，高通滤波为3 000 Hz，刺激强度从80 dB SPL至10 dB SPL，依次递减10 dB， ABR阈值以波Ⅰ作为观察指标，随着刺激声强度的递减，当波Ⅰ消失时，将刺激声强度递增5 dB SPL，重复2次，以确定阈值；同时，分别记录不同强度下ABR波Ⅰ的振幅和潜伏期。DPOAE检测：将连接有刺激声的耳塞塞入检测耳内，给与刺激强度分别为65和55 dB SPL的纯音f1、f2，设置f0依次为1、2、3、4、8、12、16、20、24以及32 kHz，f1=0.911×f0，f2=1.099×f0，f2与f1的频率比值为1.2，并记录各频率DPOAE的幅值。

1.4 分离耳蜗并制作切片 两组动物完成各时间点ABR及DPOAE检测后分别断头处死，小心分离并取出听泡，分离耳蜗，挑破蜗尖骨质、前庭窗和圆窗膜，各组部分耳蜗以0.5%的硝酸银从蜗顶灌流，再以4%多聚甲醛灌流，并置于固定液中室内光照下放置2小时，以备基底膜铺片使用；其余耳蜗4%多聚甲醛经蜗顶灌流后置于固定液中4 ℃冰箱过夜，以备切片使用。第二天将4 ℃固定的耳蜗用PBS冲洗2遍，再将其放入盛有10% EDTA脱钙液的标本瓶中，4 ℃脱钙3天，于10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脱水，放入OCT中浸泡后用冰冻切片机沿蜗轴切片，切片厚度为10 μm。

1.5 免疫荧光染色 每只耳蜗间隔取出多张切片；用预先配置的0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分钟；将切片置于0.2% TritonX-100溶液浸泡10分钟；用0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分钟；加5%正常山羊血清，室温封闭30分钟；移液器吸去封闭液，直接加上预先检测好工作浓度的一抗(兔多抗，beta-III tubulin, 1:500，ab18207，Abcam)稀释液，并置于4 ℃冰箱孵育过夜；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分钟；滤纸吸去标本周围水珠，加相应的荧光二抗(1:500)，室温暗盒孵育1小时；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分钟；DAPI溶液染核，室温暗盒孵育10分钟；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分钟；加抗荧光淬灭封片剂封片；暗室内使用正置荧光显微镜观察拍照。运用ImageJ图片处理软件计数Rosenthal’s canal内耳蜗螺旋神经元细胞(spiral ganglion neurons,SGNs)细胞的数量和面积。以神经特异性抗体β Ⅲ tubulin阳性染色的细胞计为SGNs细胞，引入校正因子Abercromie[6]以减小计数偏差，计算公式为A=T/(T+D)，T是切片厚度，D是细胞直径。本实验底、中、顶回校正因子分别为0.667、0.669、0.673。螺旋神经元细胞数=计数数量×A。

1.6 耳蜗基底膜铺片 将固定好的耳蜗置于PBS(0.01 mM)的培养皿中，显微镜直视下运用显微镊小心剔除骨性外壳、螺旋韧带、血管纹及盖膜，小心将基底膜从骨螺旋板上分离，用虹膜刀将基底膜分为三段，并将其正面朝上平铺于中间涂有甘油的载玻片上，封片；光学显微镜下观察内、外毛细胞形态并拍照保存。

1.7 统计学方法 运用Graphpad prism 5.0统计学软件对ABR、DPOAE各检测指标和SGNs细胞计数进行统计学分析，采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR及DPOAE检测结果 各组动物给药前后ABR检测结果见表1，可见给药前实验组和对照组间ABR反应阈、波Ⅰ潜伏期及振幅的差异均无统计学意义(P>0.05);给药后7、14、30天，对照组ABR反应阈、波Ⅰ潜伏期振幅与给药前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组给药后与自身给药前比较及与同时间点对照组比较，其ABR反应阈均明显升高，潜伏期均明显延长，振幅均明显降低，甚至在80 dB SPL时未引出波形，差异均有统计学意义(P<0.05)。

DPOAE结果显示(表2)，实验组和对照组间术前及给药后两组间同时间点比较，DPOAE幅值差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

表1 两组给药前后ABR反应阈(dB SPL)、波I振幅(μV)、潜伏期(ms)比较

注：*与对照组同一时间点比较,P<0.05；▲与同组给药前对应指标比较,P<0.05；#与同组给药后30 d组比较，P<0.05

表2 各频率对照组和实验组不同时间DPOAE幅值(μV)比较

注：*对照组给药后30 d测试结果

2.2 免疫荧光染色SGNs计数结果 对照组在术后7、14和30天其β-Ⅲ tubulin 染色阳性细胞数无明显改变，其骨螺旋板内神经纤维密度也未见明显降低。而与对照组相比，实验组耳蜗各回Rosenthal’s canal内β-Ⅲ tubulin 染色阳性细胞在给药后7天后细胞数量明显减少，术后30天，Rosenthal’s canal内仅见少数β Ⅲ tubulin阳性细胞存在，可见实验组SGNs数在给药后明显减少，且与同时间点对照组比较其SGNs数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，在给药后14天及30天实验组底回仍有SGNs细胞死亡发生，给药后30天底回SGNs数降至最低(表3，图1)。

表3 对照组及实验组耳蜗各回螺旋神经元细胞的密度(个/mm2)

注：△对照组给药后30 d测试结果；*与对照组比较，P<0.05；#与同组7、14 d组比较，P<0.05

图1 对照组和实验组给药后耳蜗螺旋神经元细胞变化

a～c显示实验组耳蜗底回螺旋神经元(绿色细胞，红色箭头所示)，d为对照组给药后30天螺旋神经元，可见实验组螺旋神经元细胞数在给药后明显减少，给药后30天神经元细胞数降至最低，与同时间点对照组比较神经元数量显著减少

2.3 基底膜铺片内、外毛细胞形态观察 在术后7、14和30天时，实验组及对照组耳蜗底、中及顶回的内、外毛细胞均排列整齐，未见明显形态异常或缺失；给药30天后小鼠基底膜铺片可见内外毛细胞结构完整(图2)。

图2 给药后30天小鼠耳蜗底回基底膜铺片

给药30天后，耳蜗底回内毛细胞(黄色箭头指示)及外毛细胞(白色箭头指示)结构完整，未见缺失

3 讨论

耳蜗螺旋神经元存在于耳蜗蜗轴螺旋管( Rosenthal’s canal)内，分2型，Ⅰ型螺旋神经节细胞是双极神经元，占神经元细胞的绝大部分，约95%，胞体大，轴突有髓鞘，每10～20个Ⅰ型神经元的传入纤维与一个内毛细胞建立联系；Ⅱ型螺旋神经元为单极神经元，数量少，约占神经元细胞的5%，胞体较小，轴突无髓鞘，每根Ⅱ型传入神经纤维与数十个外毛细胞联系。耳蜗螺旋神经元细胞是听觉系统非常重要的结构之一，任何原因造成其损伤均可导致感音神经性聋。目前感音神经性聋的治疗方法有助听器、人工耳蜗植入等人工听觉技术，但是其功能的有效发挥仍有赖于残余一定数量的螺旋神经元[7]。近年来，以修复耳蜗螺旋神经元为手段来治疗感音神经性聋的干细胞替代治疗越来越受到关注[8]，因此，建立精准的相关动物模型，对研究干细胞移植治疗感音神经性聋有重要作用。

哇巴因(ouabain)可以选择性抑制耳蜗螺旋神经节、螺旋缘、毛细胞和血管纹的Na+-K+-ATP酶，已被用于感音神经性聋的动物造模[2～5]。Schmedit等[4]研究发现ouabain经圆窗用药可导致沙鼠出现类似听神经病的听力学改变;Lang[9]采用1 mM ouabain经沙鼠圆窗渗透给药，发现给药后24 h时可以观察到大部分SGNs细胞出现凋亡改变，认为ouabain可特异性导致沙鼠Ⅰ型SGNs损伤，而不损伤毛细胞；Lang等[5]在小鼠内耳用1 mM ouabain经圆窗给药也得出类似结论。有研究表明0.01、0.02及0.05 mM ouabain 经圆窗给药可损伤大鼠耳蜗螺旋神经元[10]，10 mM 高浓度ouabain不仅损伤大鼠螺旋神经元而且损伤毛细胞[11]；张雪茹等[12]选择了与人类更加类似的贵州小型猪作为实验对象，比较0.1 mM和1 mM两个浓度ouabain对贵州猪内耳的影响，发现随着ouabain浓度的升高，贵州小型猪SGNs的损伤加重。上述研究结果显示ouabain对内耳组织的损伤程度及部位与动物种属、药物浓度等密切相关。由于小鼠是目前耳聋研究中最常用的哺乳动物，故本研究选用小鼠作为研究对象；既往研究用于小鼠的ouabain浓度为1 mM，为减少ouabain对小鼠螺旋神经元以外内耳组织的可能影响，本研究使用0.5 mM ouabain经圆窗给药方式，结果表明0.5 mM ouabain同样可特异性损伤小鼠耳蜗各回螺旋神经元细胞，而不损伤内外毛细胞，表现为给药后实验组小鼠ABR波Ⅰ潜伏期均明显延长、阈值明显升高、振幅明显减低，而DPOAE幅值无改变，且实验组在给药后7天耳蜗各回螺旋神经元即大量缺失，显著被损伤，而基底膜铺片显示内外毛细胞结构完整。另外，本研究中，在给药14、30天后除实验组底回仍有少数螺旋神经元死亡发生，给药后30天底回SGNs数降至最低，表明0.5 mM ouabain对螺旋神经元的损伤是急性重度并不可逆的。

本研究成功建立了特异性损伤内耳螺旋神经元的小鼠动物模型，是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。

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10 屈涓, 黄华, 王洁, 等.哇巴因对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的损伤[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2012,11:11.

11 Fu Y, Ding D, Jiang H, et al. Ouabain-induced cochlear degeneration in rat[J] . Neurotox Res,2012, 22:158.

12 张雪茹,杨仕明,李登科,等. 不同浓度Ouabain对贵州小型猪内耳形态及听力的影响[J]. 中华耳科学杂志,2013,2:279.

(2016-08-30收稿)

(本文编辑 雷培香)

An Animal Model of Specific Damage to Spiral Ganglion Neurons in the Inner Ear

Zhang Zhijian, Guan Hongxia, Yang Kun, Xiao Bokui, Liao Hua, Jiang Yang, Zhou Tao, Hua Qingquan

(Department of Otolaryngology & Head and Neck Srugery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, 430060, China)

Objective To establish an animal model of specific loss of spiral ganglion neurons in the mouse inner ear, and to lay the foundation for the study of stem cell transplantation in the treatment of sensorineural hearing loss.Methods Sixty adult female SPF grade CBA / J mice were randomly divided into experimental group and normal saline group, with 30 mice in each. The animals in the experimental group received 0.5 mM ouabain via the round window membrane, while the normal saline group used normal saline. Auditory brainstem responses (ABR) and distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) were recorded before the administration, 7 days, 14 days and 30 days after the administration respectively. Meanwhile, immunofluorescence histochemical staining was used to detect spiral ganglion neurons(SGNs)damages, and basilar membrane preparation was used to observe the changes of hair cells.Results ABR: compared with those of in the normal saline group, in the experimental group , the thresholds were elevated , the Wave I latency was prolonged, and the amplitude reduced. The differences were statistically significant (P<0.05). DPOAE: DPOAE was normally recorded in the experimental group and the control group，without significant differences between the 2 groups. The immunofluorescence results show that compared with the normal saline group, the number and density of SGNs in the cochlea of the experimental group were significantly decreased, and the differences between the 2 groups were statistically significant (P<0.05). The basilar membrane preparation showed that at different time points after the administration of ouabain , the inner and outer hair cells in the experiment group cochlear were intact , no damage or loss were observed.Conclusion The application of ouabain to the mouse inner ear via the round window membrane can specifically induce the damages of SGNs, but spare the inner and outer hair cells, thus, it is an ideal animal model for the research of stem cell transplantation treatment of sensorineural hearing loss.

Ouabain; Spiral ganglion neurons; Sensorineural hearing loss; Animal model; Stem cell therapy; Mouse

* 国家自然科学基金面上项目(81271073)、教育部留学回国基金(302-153775)资助

张志坚，女，湖北人，医学博士，副主任医师，主要研究方向为耳科学、听力学、干细胞定向分化。

华清泉(Email: hqqrm@sina.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.013

时间：2016-11-2 16:18

R764.3

A

1006-7299(2016)06-0583-05

1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科 (武汉 430060)

# 共同第一作者

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.008.html