运动和饮食调整对非酒精性脂肪肝大鼠内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路的影响

李军汉，孙君志，李 恩，张仲阳，苏全生

运动和饮食调整对非酒精性脂肪肝大鼠内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路的影响

李军汉1，2，孙君志1，李 恩3，张仲阳1，苏全生1

目的：观察内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路在非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的变化，探讨运动和饮食调整对非酒精性脂肪肝的干预作用及作用机理。方法：SD雄性大鼠随机分为对照组（20只）和模型组（50只）2组，对照组给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料喂养。第8周，对照组和模型组各取10只做肝脏病理切片。确定NAFLD模型成功后，模型组随机分为4组：模型组（M）、运动组（EM）、饮食调整组（FM）和运动结合饮食调整组（EFM），每组各10只，对照组剩余10只大鼠编为C组。C组继续普通饲料喂养，M组和EM组继续高脂饲料喂养，FM组和EFM组由高脂饲料改为普通饲料喂养；EM组、EFM组给予有氧游泳运动干预，连续8周，直至第16周实验结束。HE染色观察肝脏病理形态，Western blot检测PERK、eIF-2a和IRE-1、XBP-1蛋白表达，结果：（1）与C组比较，M组肝细胞脂肪变性加重，PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达增加；（2）与M组比较，各干预组肝细胞脂肪变性减轻，PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达降低；（3）M组、EM组、FM组、EFM组4组双因素方差结果示：运动和饮食对PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达具有主效应，且二者具有交互作用。结论：运动和饮食调整对NAFLD发展具有较好的干预作用，且二者联合作用效果更佳，其机制可能与其降低PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达，减少内质网应激有关。

内质网应激；非酒精性脂肪肝；运动；饮食

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的病理综合征［1］。近年来，NAFLD发病率呈上升趋势，严重危害人民健康，但其发生机制仍不清楚［2］。研究［3-4］报道，ERS在心血管、神经元变性和糖尿病等疾病中起着重要作用。有关ERS相关蛋白在NAFLD中的作用机制，国内外仅有少量文献［5-6］报道。迄今为止，内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路在NAFLD中的作用尚未见文献报道。本研究拟通过高脂饲料喂养诱导大鼠NAFLD动物模型，并采用运动和饮食调整单独或联合干预，探讨NAFLD发展中的内质网应激作用机制及运动和饮食调整的干预作用及作用机理。

1　材料与方法

1.1实验动物

8周龄SD雄性大鼠70只，体重为196.16± 6.96克，SPF／VAF级，分笼饲养，自由饮食饮水，相对湿度45%-55%，室温18-22℃，12小时光照和12小时熄灯模拟昼夜交替。

1.2分组与喂养

所有大鼠适应性喂养3天后，随机分为对照组（20只）和模型组（50只）两组。对照组给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料喂养。8周后，两组各随机抽取10只做肝脏病理切片，确定NAFLD造模成功后，将模型组剩余大鼠随机分为4组：模型组（M）、运动组（EM）、饮食调整组（FM）和运动结合饮食调整组（EFM），每组各10只，对照组剩余大鼠编为C组。C组继续普通饲料喂养，M组和EM组继续高脂饲料喂养，FM组和EFM组由高脂饲料改为普通饲料喂养；EM组、EFM组给予有氧游泳运动干预，连续8周，直至第16周实验结束。高脂饲料［7］配方如下：基础饲料71.8%、胆固醇2.0%、猪油18%、蛋黄粉8%、胆盐0.2%。

1.3运动方法

运动方式参照文献报道［8］，实验前，EM、EFM组先进行3 d适应性游泳练习，每次15 min，每次递增10-20 min，每天1次，经1周增加至60 min，直至实验结束，各周都维持此运动量。正式运动期间每次60 min，每天1次，每周运动6 d。运动条件：长150 cm×宽60 cm×高70 cm的游泳池，水深60 cm，超过大鼠身长的2倍，水温31±1℃。

1.4样本采集与处理

大鼠禁食12h，称重后以4ml／kg的2%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉，新洁尔灭消毒后以腹部正中切口打开腹腔，迅速取出肝脏，在4℃生理盐水中反复漂洗，取肝左叶中部1cm×1cm×1cm，在液氮中速冻后转入-80℃冰箱储存，用于Western bolt检测。取肝右叶一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。

1.5测试指标与方法

1.5.1HE染色观察肝脏病理形态

常规石蜡包埋切片，HE染色后，在光镜下观察肝脏病理变化，根据肝细胞脂肪变所占面积进行评分［9］。

1.5.2Western blot检测PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1蛋白表达

将50 mg的冰冻肝组织置于匀浆器中，用组织裂解液裂解 30 min后，12 000r／min，4℃离心30min，取上清，BCA法测定总蛋白含量。取组织匀浆采用10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，4℃电转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，洗膜3次，每次10min。分别用兔单抗 PERK（1：2 000，abcam公司）、兔单抗eIF-2a（1：2 000，abcam公司）、兔单抗IRE-1（1：2000，abcam公司）、兔单抗XBP-1（1：1 000，abcam公司）和兔单抗β-actin（1：1 000，abcam公司）室温孵育1h后，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10min，分别加入相应的HRP结合的羊抗兔IgG（1：2000，abcam公司）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，DAB显色，自来水冲洗，观察结果并扫描，重复3次。

1.6数理统计方法

数据采用统计软件SPSS 18.0进行处理，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），M组、EM组、FM组和EFM组4组比较采用双因素方差分析（Univariate），P＜0.01为非常显著性差异，P＜0.05为显著性差异。

2　研究结果

2.1各组肝组织病理形态变化

HE染色结果显示（见图1）：C组所有大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状排列，细胞质内少量脂肪性变；M组所有大鼠肝细胞脂肪变性显著，胞浆内充满大量脂肪空泡，肝细胞排列紊乱，体积较正常增加，肝窦扩张和淤血，肝小叶内可见大量炎症，汇管区有淋巴细胞浸润或纤维组织增生；EM组、FM组、EFM组肝细胞脂肪变性程度位于C组和M组之间。肝细胞脂性变积分（见表1）结果显示：与C组比较，其余各组肝细胞脂肪变程度积分升高明显，具有非常显著性差异（P＜0.01），各干预组肝细胞脂肪变程度积分较M组降低，具有显著性差异（P＜0.05）。

图1　各组肝脏HE染色病理变化（×200）Graph 1 Pathological changes in liver tissues in all groups by HE staining

表1　第16周各组大鼠肝细胞脂性变积分变化Table 1 Changes in integral values of rats’hepatocyte steatosis in all groups

2.2各组大鼠肝脏内质网应激PERK／eIF-2a通路蛋白表达变化

各组大鼠肝组织PERK、eIF-2a蛋白表达（如图2、表2）结果显示：与C组比较，其余各组PERK、eIF-2a蛋白表达升高，具有非常显著性差异（P＜0.01）；与M组比较，各干预组PERK、eIF-2a蛋白表达降低，具有非常显著性差异（P＜0.01）。M组、EM组、FM组、EFM组4组双因素方差分析结果显示，运动和饮食对PERK、eIF-2a蛋白表达的影响具有主效应（P＜0.01）；运动和饮食对PERK、eIF-2a蛋白表达的影响具有交互作用（P＜0.01）。

图2　各组大鼠肝脏PERK、eIF-2a蛋白表达变化Graph 2 Changes in protein expression of liver PERK，eIF-2a in all groups

表2　各组大鼠肝脏PERK、eIF-2a蛋白表达变化（±s）Table 2 Changes in protein expression of liver PERK，eIF -2a in all groups（±s）

表2　各组大鼠肝脏PERK、eIF-2a蛋白表达变化（±s）Table 2 Changes in protein expression of liver PERK，eIF -2a in all groups（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与M组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；M组、EM组、FM组与EFM组组间双因素方差分析比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别　PERK　eIF-2a C组　0.244±0.047　0.666±0.076 M组　0.934±0.079**　2.222±0.181**EM组　0.617±0.067**△△＃＃　1.010±0.098**△△＃＃FM组　0.735±0.074**△△＃＃　1.151±0.172**△△＃＃EFM组　0.509±0.052**△△＃＃　0.870±0.071**△△＃＃

2.3各组大鼠肝脏内质网应激IRE-1／XBP-1通路蛋白表达变化

各组大鼠肝组织IRE-1、XBP-1蛋白表达（如图3、表3）结果显示：与C组比较，其余各组IRE-1、XBP-1蛋白表达升高，具有非常显著性差异（P＜0.01）；与M组比较，各干预组IRE-1、XBP-1蛋白表达降低，具有非常显著性差异（P＜0.01）。M组、EM组、FM组、EFM组4组双因素方差分析结果显示，运动和饮食对IRE-1、XBP-1蛋白表达的影响具有主效应（P＜0.01）；运动和饮食对IRE-1、XBP-1蛋白表达的影响具有交互作用（P＜0.01）。

图3　各组大鼠肝脏IRE-1、XBP-1蛋白表达变化Graph 3 Changes in protein expression of liverIRE-1，XBP-1 in all groups

表3　各组大鼠肝脏IRE-1、XBP-1蛋白表达变化（±s）Table 3 Changes in protein expression of liverIRE-1，XBP -1 in all groups（±s）

表3　各组大鼠肝脏IRE-1、XBP-1蛋白表达变化（±s）Table 3 Changes in protein expression of liverIRE-1，XBP -1 in all groups（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与M组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；M组、EM组、FM组与EFM组组间双因素方差分析比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别　IRE-1　XBP-1 C组　0.358±0.038　0.325±0.037 M组　1.361±0.114**　1.333±0.111**EM组　0.646±0.066**△△＃＃　0.726±0.079**△△＃＃FM组　0.707±0.077**△△＃＃　0.855±0.088**△△＃＃EFM组　0.587±0.056**△△＃＃　0.684±0.064**△△＃＃

3　讨论与分析

3.1内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路与NAFLD

内质网具有蛋白质合成、折叠、组装、修饰等功能，是真核细胞中的重要细胞器。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指各种刺激导致大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网内聚集引发的反应。目前，ERS研究较清楚的通路为UPR［10］。

UPR由内质网腔内的分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）与内质网膜上RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、激活转录因子（activating transcription factor，ATF6）和需肌醇酶（inositol requiring kinase，IRE-1）3种跨膜信号转导蛋白介导［11］。在生理状态下，GRP78与PERK、IRE-1和 ATF6结合，处于无活性状态。ERS时，GRP78与PERK、IRE-1和ATF6解离，解离后的3种信号转导蛋白处于活化状态，启动PERK／eIF-2a、IRE-1／XBP-1UPR和ATF6三条主要信号通路［12］。

有研究［13］证实，PERK／eIF-2a和IRE-I／XBP-1通路与脂肪肝的发生密切相关，ATF-6通路与持续ERS时晚期凋亡变化有关。故本研究着重探讨PERK／eIF-2a和IRE-I／XBP-1通路在非酒精性脂肪肝中的作用。内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路在NAFLD中的作用，国内外尚未见文献报道。本研究结果显示：PERK、eIF-2a和IRE-1、XBP-1在生理状态下也少量表达，与对照组比较，模型组PERK、eIF-2a和IRE-1、XBP-1蛋白表达升高，具有非常显著性差异（P＜0.01），提示ERS通过PERK／eIF-2a和IRE-I／XBP-1通路参与高脂饮食诱导NAFLD的发展。

3.2运动和饮食调整对NAFLD的干预作用

有氧运动和饮食调整被公认为是治疗NAFLD最基本而有效的方法［14］。有氧运动对NAFLD的作用机制主要体现在降低肝脏脂肪堆积、调节脂质代谢、降低胰岛素受体活性、增加胰岛素敏感性、抑制凋亡、减少氧化应激和炎症等方面。运动对NAFLD内质网应激的作用机制尚未见有文献报道。本研究结果显示，与模型组比较，运动组肝脏PERK、eIF -2a和IRE-1、XBP-1蛋白表达降低，具有非常显著性差异（P＜0.01），提示运动对NAFLD的作用机制可能与其减少ERS，降低其PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达有关。

饮食调整对NAFLD的作用多见于临床研究报道，其对NAFLD大鼠肝脏内质网应激的作用机制尚未见文献报道，本研究结果显示：与模型组比较，饮食调整组肝脏ERS介导PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达降低，具有非常显著性差异（P＜0.01），提示饮食调整干预NAFLD的作用机制可能与其减少ERS，降低其PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达有关。

对于运动与饮食调整联合干预对NAFLD治疗的交互作用，国内外有少量文献报道。临床随机对照实验［15］发现运动结合饮食调整对NAFLD患者肝脏病理组织学改变显著。本研究结果显示：与模型组比较，运动结合饮食调整组肝脏PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达显著下降，提示运动结合饮食调整通过降低ERS PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达、减少ERS，从而对NAFLD发挥干预作用。双因素方差分析结果显示，运动和饮食对NAFLD大鼠肝组织PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达的影响具交互作用，提示运动和饮食调整联合作用疗效优于单独作用。

4　结论

内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路参与NAFLD的发展。NAFLD形成后，采用运动和饮食调整单独或联合干预，一定程度上可延缓NAFLD的发展，且二者联合作用效果更显著，其机制可能与运动和饮食调整可降低内质网应激PERK／eIF-2a和IRE-1／XBP-1通路蛋白表达，减少内质网应激有关。

［1］ Alkhater S A.Paediatric non-alcoholic fatty liver disease：an overview［J］.Obes Rev，2015，16（5）：393-405.

［2］ 宋光耀，任路平.非酒精性脂肪肝疾病发生机制研究新进展［J］.中国老年学杂志，2012，32（3）：664-666.

［3］ Oakes S A，Papa F R.The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology［J］.Annu Rev Pathol，2015，10：173-194.

［4］ Byrne C D，Targher G.Ectopic fat，insulin resistance，and nonalcoholic fatty liver disease：implications for cardiovascular disease［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（6）：1155 -1161.

［5］ Pagliassotti M J.Endoplasmic reticulum stress in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Annu Rev Nutr，2012，32：17-33.

［6］ 陈潇迪，陈东风，王军，等.非酒精性脂肪性肝病细胞凋亡的内质网应激启动机制［J］.现代生物医学进展，2013（6）：1172 -1175.

［7］ 常薪霞.盐酸小檗碱对高脂饮食诱导的SD大鼠非酒精性脂肪肝的疗效及机制研究［D］.上海：复旦大学，2010.

［8］ 唐智明，邓玉强，吴健，等.长期游泳运动对2型糖尿病大鼠Musclin分泌和脂质代谢的影响［J］.中国运动医学杂志，2011，30（12）：1078-1081.

［9］ 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（3）：163-166.

［10］ Mesitov M V，Moskovtsev A A，Kubatiev A A.Molecular logic of the endoplasmic reticulum stress signal pathways：the system of unfolded protein response［J］.Patol Fiziol Eksp Ter，2013（4）：97-108.

［11］ Anholt R R，Carbone M A.A molecular mechanism for glaucoma：endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response［J］.Trends Mol Med，2013，19（10）：586-593.

［12］ Samali A，Fitzgerald U，Deegan S，et al.Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response［J］.Int J Cell Biol，2010，8303-07.

［13］ Zhang Q，Li Y，Liang T，et al.ER stress and autophagy dysfunction contribute to fatty liver in diabetic mice［J］.Int J Biol Sci，2015，11（5）：559-568.

［14］ Jin Y J，Kim K M，Hwang S，et al.Exercise and diet modification in non-obese non-alcoholic fatty liver disease：analysis of biopsies of living liver donors［J］.J Gastroenterol Hepatol，2012，27（8）：1341-1347.

［15］ Vilar G E，Rodriguez D M A，Gra O B，et al.Clinical trial：a nutritional supplement Viusid，in combination with diet and exercise，in patients with nonalcoholic fatty liver disease［J］.Aliment Pharmacol Ther，2009，30（10）：999-1009.

Objective：To observe the change of eIF-2a PERK／and IRE-1／XBP-1 pathway induced by endoplasmic reticulum stress in nonalcoholic fatty liver disease and explore the role of exercise and dietary modification and its mechanism.Methods：12 rats were randomly selected from 42 rats as the control group，the rest 30 rats were the model group.Control group was fed with ordinary diet，model group was fed with high-fat diet.At the 8th week of experiment，6 rats in control and model group were respectively chose for liver pathological to determine whether NAFLD model was successfully made.Model group were randomly divided into 4 groups：model group（M），exercise group（EM），diet modification group（FM）and exercise combined with diet modification group（EFM），each 6 rats.The remaining 6 rats of control group were as C group.Group C was continued to ordinary diet.Group M and EM were continued to high fat diet.Group FM and EFM were fed from high fat diet to ordinary diet.Group EM and EFM were intervened by aerobic swimming exercise for 8 weeks until the end of experiment.We observed the pathological changes in liver tissue by HE staining.Western blot was employed to explore the protein expression of eukaryotic initiation factor 2 α（eIF-2a）and protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase（PERK）and inositol-requiring Enzyme 1（IRE-1）and X-boxbinding Protein 1（XBP-1）.Results：（1）Compared to group C，hepatocyte steatosis is aggravating and protein expression of PERK／eIF-2a and IRE-1／XBP-1 pathway gene increased in M group；（2）Compared to group M，liver steatosis relived and protein expression of PERK／eIF-2a and IRE-1／XBP-1 pathway gene reduced in intervention groups；（3）The result of two-way anova in Group M and EM and FM and EFM showed that exercise and diet had a main effect on protein expression of PERK／eIF-2a and IRE-1／XBP-1 pathway gene and they had a interactive effect.Conclusions：Exercise and diet modification had an good effect on NAFLD and the effect of exercise combined with diet modification was better，which may be related to the decrease of protein expression of PERK／eIF-2a and IRE-1／XBP-1 pathway gene and reducing endoplasmic reticulum stress.

（编辑 孙君志）

The Effect of Exercise and Dietary Modification on PERK／eIF-2a and IRE-1／XBP-1 Pathway Induced by Endoplasmic Reticulum Stress in Nonalcoholic Fatty Liver Disease

LI Junhan1，2，SUN Junzhi1，LI En3，ZHANG Zhongyang1，SU Quansheng1

Endoplasmic Reticulum Stress；Non-alcoholic Fatty Liver Disease；Exercise；Diet Modification

G804.2 Document code：A Article ID：1001-9154（2016）06-0110-05

A

1001-9154（2016）06-0110-05

10.15942／j.jcsu.2016.06.00

“十二五”国家科技支撑计划重点项目（2012BAK21B01）；四川省科技厅应用基础计划项目（2015JY0155）；国家体育总局运动医学重点实验室暨运动医学四川省重点实验室资助基金（CTYY2015018）。

李军汉，博士，讲师，研究方向：运动生理学，E-mail：LLjunhao＠163.com。

1.成都体育学院运动医学与健康学院，四川 成都610041；2.北京体育大学研究生院，北京100081；3.雅安职业技术学院，四川雅安625018 1.School of Sports Medicine and Health，Chengdu Sport Institute，Chengdu Sichuan 610041；2.The Graduate College of Beijing Sport University，Beijing 100084；3.Ya’an Vocational Technical Institute，Ya’an Sichuan 625018

2016-03-20

2016-06-03