大豆凝集素的超声波辅助提取工艺优化及其性质

赵妍嫣，秦新生，朱圣伟，郑 志*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009）

大豆凝集素的超声波辅助提取工艺优化及其性质

赵妍嫣，秦新生，朱圣伟，郑 志*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009）

采用响应面法优化超声波辅助提取大豆凝集素的最佳工艺参数。在单因素试验的基础上，以超声时间、提取温度、提取时间、液料比为自变量，以凝集素提取得率为响应值，优化得到大豆凝集素的最佳提取工艺为：超声时间38 min、提取温度32 ℃、提取时间5.6 h、液料比10∶1（mL/g）。在此条件下得到的凝集素提取得率为9.82%。稳定性测定结果表明：大豆凝集素的最适pH值为7～8，在Ca2+溶液中较稳定。D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺对大豆凝集素的凝集活力影响大，是大豆凝集素的专一性抑制糖。

大豆蛋白；凝集素；超声波；响应面分析；稳定性

赵妍嫣, 秦新生, 朱圣伟, 等. 大豆凝集素的超声波辅助提取工艺优化及其性质[J]. 食品科学, 2016, 37(10): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610007. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yanyan, QIN Xinsheng, ZHU Shengwei, et al. Ultrasonic-assisted extraction and properties of lectin from soybean protein[J]. Food Science, 2016, 37(10): 34-39. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610007. http://www.spkx.net.cn

大豆蛋白具有丰富的营养价值，是一种优质的植物蛋白源[1]。大豆凝集素是大豆中含有的一类可促使细胞凝集的高度专一性糖蛋白，含量占到蛋白质总量的10%左右[2-5]。大豆凝集素具有凝集细胞的特性，因此可以结合血红细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌表面的糖结构，从而达到抵御人体病毒入侵、抑制病毒生长的生理功效。因此，目前大豆凝集素在免疫学、食品营养学等领域被较广泛应用[6-9]。

大豆蛋白是获取凝集素的主要原料，目前从大豆中提取凝集素的研究，主要集中在传统的加热制备提取，如黄泽华等[10]用响应面法优化兔血红细胞检测绿豆凝集素的凝集活性。冀爱青等[11]对比研究了5 种核桃仁凝集素的提取工艺和理化性质，发现不同品种的核桃仁对细胞的凝集活性有所差异。与传统的加热提取工艺相比，超声波辅助提取技术因其经济方便、提取时间短、对物

质结构及理化性质影响较小，在植物提取中被广泛应用，但目前采用超声波辅助提取植物凝集素的研究较少。本实验以超声波技术辅助提取大豆凝集素，减少了提取时间和成本，通过对提取物稳定性质的研究，为大豆凝集素的活性研究和生物学应用开发提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆蛋白粉 河南省鲲华生物技术有限公司；新鲜猪血 市售；96孔V型血凝计数板、凝集素芯片 国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

CP114型电子天平 奥豪斯仪器上海有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；SB-5200D型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆凝集素的超声波提取

称取1 g过筛的大豆蛋白粉，按一定液料比加入浸提液，在恒温水浴锅中经超声波处理一定时间，于3 000 r/min离心15 min，弃去沉淀，取上清液至离心管中3 000 r/min再离心20 min，得到上清液保藏于4 ℃后进行凝集素的盐析纯化和蛋白浓度理化性质测定[12-13]。以不同种类的浸提液作为溶剂，分别以超声时间、提取温度、提取时间、液料比为自变量因素，以大豆凝集素提取得率为指标进行单因素试验，进行3 次试验取平均值。大豆凝集素提取得率的计算见公式（1）：

1.3.2 大豆凝集素的血凝活性测定

凝集素活力单位及比活力计算见公式（2）、（3）[14-16]：

1.3.3 大豆凝集素提取的响应面优化

通过单因素试验，分别以A、B、C、D表示超声时间、提取温度、提取时间、液料比（mL/g）4 个主要影响因素，并以-1、0、1分别代表因素的水平，以大豆凝集素提取得率为响应值，设置四因素三水平的响应面试验，采用Design-Expert软件进行Box-Behnken设计，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded and actual values for the factors used in response surface analysis (RSA)

1.3.4 大豆凝集素的理化性质测定

1.3.4.1 酸碱稳定性的测定[17-18]

在96 孔V型血凝板上倍比稀释后进行血凝实验，用猪血红细胞测定不同pH值条件下的大豆凝集素的凝集活力。

1.3.4.2 金属离子稳定性的测定[19]

用猪血红细胞测定不同金属离子添加后的大豆凝集素的凝集活力。所选金属离子为Cu2+、Zn2+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Hg2+。

1.3.4.3 糖专一性抑制的测定[20]

用猪血红细胞测定不同糖添加后的大豆凝集素的凝集活力，以磷酸盐缓冲液为空白对照。所用糖分别为D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-乙酰乳糖胺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提液对凝集素提取得率的影响

图1 浸提液对凝集素提取得率的影响Fig. 1 Effect of extraction solvents on the extraction yield of soybean lectin

由图1可知，在相同的超声时间、提取时间、提取温度和液料比的条件下，用生理盐水和磷酸缓冲液得到的凝集素的提取得率较高，生理盐水作为浸提液时提取得率最高，达到9.73%，是最好的大豆凝集素提取溶剂[10]。

2.1.2 超声时间对凝集素提取得率的影响

如图2所示，超声时间40 min大豆凝集素提取得率达到最高。超声波可以使大豆蛋白亚基结构解离，凝集素得以大量释放。随着超声时间的延长，提取得率开始降低，原因是超声波引起的空洞效应作用力的下降，使得凝集素表面吸附力增加，从而降低得率[21]。

图2 超声时间对凝集素提取得率的影响Fig. 2 Effect of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of soybean lectin

2.1.3 提取温度对凝集素提取得率的影响

图3 提取温度对凝集素提取得率的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of soybean lectin

由图3可知，随着提取温度升高，大豆凝集素提取得率在提取温度为30 ℃时达到最大值，为9.73%。因为温度的升高会加剧凝集素的扩散。当温度高于30 ℃时，大豆凝集素提取得率有所降低，是由于温度过高会损害凝集素的活力和结构。因此，30 ℃为大豆凝集素最佳提取温度[18]。

2.1.4 提取时间对凝集素提取得率的影响

图4 提取时间对凝集素提取得率的影响Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction yield of soybean lectin

由图4可知，随着提取时间的延长，凝集素提取得率不断上升，在6 h达到最大，随后开始下降。原因在于随着提取时间的延长，大豆凝集素在浸提液中不断被溶解，但随后时间越长却不再有更多凝集素提取出，而不断地搅拌会使凝集素与空气过度接触而被氧化，导致凝集素提取得率下降。所以选择6 h作为凝集素提取的最佳时间[19]。

2.1.5 液料比对凝集素提取得率的影响

图5 液料比对凝集素提取得率的影响Fig. 5 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of soybean lectin

如图5所示，大豆凝集素的提取得率随液料比的增加有先上升后下降的趋势，刚开始随着溶剂量的增加，溶液中凝集素浓度降低，导致扩散的压力差增加，利于凝集素扩散。在液料比为10∶1（mL/g）时凝集素提取得率达到最大。后再增加溶剂量，凝集素的溶解量固定，考虑到实际操作使得提取得率下降，因此选择10∶1（mL/g）作为凝集素提取的最佳液料比[8]。

2.2 响应面分析法优化大豆凝集素提取的最优条件

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

以超声时间、提取温度、提取时间、液料比为自变量，以凝集素提取得率为响应值，响应面试验分析及结果如表2所示。

表2 响应面试验分析及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立及显著性检验

采用Design-Expert软件对表2所得的大豆凝集素提取得率试验数据进行回归拟合（表3），得到超声时间（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）为自变量对大豆凝集素提取得率的回归方程：凝集素提取得率/%=9.73+0.36A+0.14B+0.077C-0.27D+0.03AB+ 0.02AC-0.012AD-0.012BC+0.007 5CD-0.9A2-0.62B2-1.15C2-0.33D2。通过回归模型的方差分析表得出，整体模型的P＜0.01，表明二次模型极显著，失拟项P=0.527 7＞0.05，不显著，表明此二项模型拟合有效，可以分析和预测各因素与响应值的关系。各影响因素的主次顺序为：A超声时间＞D液料比＞B提取温度＞C提取时间。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the fi tted quadratic regression model (with extraction yield as response)

2.2.3 各因素的响应面分析

图6 各因素交互作用对凝集素提取得率的影响Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effect of extraction parameters on the yield of soybean lectin

等高线的形状反映了两因素的交互效应，椭圆形越密集，表明两因素交互作用越显著[22-24]。由图6可得到最佳工艺条件，超声时间和提取温度、超声时间和提取时间、提取温度和提取时间3 组图曲线坡度较大，对凝集素提取得率影响显著；超声时间和液料比、提取温度和液料比、提取时间和液料比3 组图曲线较平缓，对凝集素提取得率影响较弱。

2.2.4 大豆凝集素提取的最优条件的确定

由Design-Expert软件可求得回归方程的极值点，得

到凝集素提取最佳工艺条件为：超声时间38.2 min、提取温度31.6 ℃、提取时间5.57 h、液料比9.72∶1。所用浸提液为生理盐水，在此条件下，大豆凝集素的理论预测提取得率为9.79%。对最佳提取条件进行验证实验，考虑到实际操作，将最佳工艺参数修正为：超声时间38 min、提取温度32 ℃、提取时间5.6 h、液料比10∶1。测得凝集素的提取得率为9.82%，与预测值接近。

2.3 大豆凝集素的理化性质

2.3.1 酸碱稳定性

表4 pH值对大豆凝集素活力的影响Table 4 Effect of pH on the activity of soybean lectin

由表4可知，大豆凝集素的凝集活力受pH值的影响较大，最适pH值为7～8，在强碱环境中几乎丧失活性。在极端pH值环境下，高静电推斥能量导致凝集素蛋白分子的膨胀和展开，使得蛋白质分子内部的巯基和羧基发生离子化，造成凝集素蛋白多肽链的空间结构发生不可逆的变性[25]。

2.3.2 金属离子稳定性

表5 金属离子对大豆凝集素活力的影响Table 5 Effect of metal ions on the activity of soybean lectin

由表5可知，不同金属离子对大豆凝集素的凝集活力影响不同，在含有Ca2+的溶液中大豆凝集素凝集活性最强，稳定性最好；Cu2+、Mg2+、Hg2+略微降低了大豆凝集素的凝集活性[10]。

2.3.3 糖专一性抑制

表6 糖溶液对大豆凝集素活力的影响Table 6 Effect of sugar solutions on the activity of soybean lectin

如表6所示，在所提供的8 种糖中，大豆凝集素可与D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺专一性结合，凝集活力较低，说明大豆凝集素容易与乙酰化的糖结合，因此D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺是大豆凝集素的专一性抑制糖。而其他单糖和寡糖对大豆凝集素的凝集活力影响不大，说明大豆凝集素的蛋白结构上含有结合糖的乙酰化衍生物的受体[10]。

3 结 论

本研究通过单因素试验和响应面法对大豆凝集素的提取工艺进行了优化，得到提取最佳工艺参数为：超声时间38 min、提取温度32 ℃、提取时间5.6 h、液料比10∶1。在此条件下得到的大豆凝集素的提取得率为9.82%。

对大豆凝集素的理化性质进行测定发现，大豆凝集素在pH值为7～8的中性环境中较稳定；在含有Ca2+的溶液中大豆凝集素凝集活性最强；D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺是大豆凝集素的专一性抑制糖。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Properties of Lectin from Soybean Protein

ZHAO Yanyan, QIN Xinsheng, ZHU Shengwei, ZHENG Zhi*
(Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of lectin from soybean protein. A regression model was developed to describe the yield of lectin from soybean protein as a function of 4 independent variables including ultrasonic irradiation time, extraction temperature, extraction time and liquid-to-solid ratio. The optimum extraction parameters were determined as follows: ultrasonic irradiation time, 38 min; extraction temperature, 32 ℃; extraction time, 5.6 h; and liquid-to-solid ratio, 10:1 (mL/g). Under these conditions, the yield of lectin was 9.82%, which was in good agreement with the result predicted by the model. The stability test showed that the optimal pH for the soybean lectin was 7–8. Ca2+played an important role in the agglutination reaction induced by it. The agglutination activity of the lectin could be inhibited by D-acetyl glucosamine and D-acetyl galactose amine.

soybean protein; lectin; ultrasonic; response surface methodology; stability

10.7506/spkx1002-6630-201610007

Q946.1

A

2015-09-07

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102201）；安徽省科技攻关项目（1301031031）

赵妍嫣（1972—），女，副教授，博士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：zhaoyanyan@hfut.edu.cn

*通信作者：郑志（1971—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn