直接测序法与荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变对比分析

闵生萍



·论著研究·

直接测序法与荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变对比分析

闵生萍

目的：比较直接测序和荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR基因突变状态结果的差异。方法:分别采用荧光定量PCR(蝎形探针扩增阻滞突变系统ARMS)和直接测序法检测155例石蜡包埋NSCLC样本中EGFR基因18，19，20，21号外显子突变状态,比较检测结果的差异。结果：80例手术切除样本中，直接测序检测EGFR突变阳性者25例(31.25%)，ARMS法为28例(35%)，差异无统计学意义(P>0.05)；75例活检样本中，直接测序检测EGFR突变阳性者19例(25.33%)，ARMS法为26例(34.67%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：对于手术切除样本，直接测序和ARMS法均可有效检测出EGFR基因突变状态；但对于活检组织样本，ARMS较直接测序灵敏性更高。

癌，非小细胞肺； 表皮生长因子受体； 基因突变; 直接测序; 荧光光定量PCR

随着癌症基因组学计划的实施和药物基因组学的发展,人们对癌症发病机制的认识逐步上升到了分子水平。靶向治疗随之迅猛发展，精准医学的理念亦应运而生，成为恶性肿瘤诊疗发展的未来方向和必然趋势。临床研究已经证实，以吉非替尼等为代表的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂类(EGFR-TKIs)药物可显著延长非小细胞肺癌(NSCLC)患者的无疾病进展生存期和总生存期[1-2]，但其疗效与表皮生长因子受体(EGFR)基因突变状态密切相关，因此，EGFR基因突变检测成为EGFR-TKIs药物临床应用的前提和基础。目前,EGFR基因突变的检测方法有很多,主要包搞直接测序法、实时荧光定量PCR、高效液相色谱法等，在临床检测中最常用的方法为直接测序和荧光定量PCR法。直接测序法具有较强的特异性，而且可发现未知的突变,其曾被誉为基因突变检测的“金标准”,但是其步骤繁琐，耗时较长，结果判读难度较大。PCR法相对测序而言，灵敏度高、操作简捷、较易判读，但其只能检测已知突变位点。本研究中,笔者分别采用直接测序法和荧光定量PCR法检测NSCLC样本中EGFR基因突变状态,比较2种方法检测结果的差异,旨在为规范EGFR突变检测方法的临床应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)标本收集:收集蚌埠医学院第一附属医院2014年1月-2016年6月期间,经病理学确诊的NSCLC患者组织样本155例,其中:手术切除样本80例，气管镜活检样本55例，经皮肺穿刺活检样本20例。(2)样本处理:肿瘤组织样本均在离体后1 h内用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,每例样本均连续切片8～10张,每张厚度为5 μm,第1张用于常规HE染色,确定肿瘤细胞区域，其余用于DNA提取。

1.2 方法 (1)DNA的提取:采用DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国凯杰公司)，参照说明书操作步骤进行石蜡切片DNA提取。采用Thermo Fisher公司的NanoDrop2000超微量分光光度计对提取后的DNA浓度和纯度进行检测，其中OD260/OD280要求在1.8～2.0之间。(2)直接测序分析:根据GenBank公开发表的人EGFR基因序列 (编号AY588246)，采用ABI PrismTM Primer Express 软件，采用 PCR扩增法分别扩增EGFR 第18～21外显子。其引物序列分别是：第18号外显子上游引物(顺义链)5’-GAGGTGACCCTTGTCTCTGTGT-3’，下游引物(反义链)5’-CCCAAACACTCAGTGAAACAAA - 3 ’ ；第 1 9 外显子上游引物 ( 顺义链)5’-TGCCAGTTAACGTCTTCCTTCT-3’，下游引物(反义链)5’-TGAACATTTAGGATGTGGAGAT- 3 ’ ；第 2 0 外显子上游引物 ( 顺义链)5’-ACTTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’，下游引物(反义链)5’-ATGGGACAGGCACTGATTTGT- 3 ’ ；第 2 1 外显子上游引物(顺义链)5’-GAGCTTCTTCCCATGATGATCT-3’，下游引物(反义链)5’-GAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’。PCR扩增产物经纯化后用ABI377测序仪进行双向测序，测序结果采用Chromas软件进行分析。(3)荧光定量PCR检测:按照人类EGFR基因突变检测试剂盒(苏州为真生物科技有限公司)说明书的操作步骤，采用蝎形探针扩增阻滞突变系统(ARMS)法，应用实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480II)检测样本中EGFR第18～21外显子的突变情况。PCR扩增过程包括三个阶段，第一阶段包含1个循环(95℃，5 min)，第二阶段包含45个循环(95℃，20s；63℃，40s)，第三阶段包含1个循环(40℃，10s)。最终反应结果以试剂盒提供的判读原则确定标本EGFR基因突变状态。

1.3 统计学方法 所有统计学检验采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

155例入组的患者中，直接测序法检测到EGFR基因突变阳性者44例，阳性率为28.38%(44/155)；ARMS法检测到EGFR基因突变阳性者54例，阳性率为34.83%(54/155)，后者阳性率高于前者(P<0.05)。见表1。

表1 直接测序与ARMS法检测所有样本EGFR基因突变结果比较

80例手术样本中，直接测序法检测到EGFR基因突变阳性者26例，阳性率为31.25%(25/80)，ARMS法检测到EGFR基因突变阳性者28例，阳性率为35%(28/80)，2种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 直接测序与ARMS法检测手术切除样本EGFR基因突变结果比较

75例活检小标本中，直接测序法检测到EGFR基因突变阳性者19例，阳性率为25.33%(19/75)，ARMS法检测到EGFR基因突变阳性者26例，阳性率为34.67%(26/75)，ARMS法检测小标本中EGFR基因突变的阳性率明显高于直接测序法(P<0.01)。见表3。

表3 直接测序与ARMS法检测小样本EGFR基因突变结果比较

3 讨论

肺癌的发病率﹑死亡率在我国及全球范围内均居恶性肿瘤之首位[3-4],其对人们健康已构成严重威胁。以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗，开辟肺癌治疗的新途径。己有多项临床研究证实，EGFR突变阳性的NSCLC患者对EGFR-TKIs的反应率显著高于EGFR野生型患者，无进展生存时间(PFS)和总生存期(OS)也显著延长[5]。因此，明确NSCLC患者EGFR基因突变状态及其突变类型，无疑有助于筛选出适合EGFR-TKIs治疗的人群。

由于大多数NSCLC患者确诊时已处于中、晚期，临床治疗上失去了手术机会，所能获得的组织样本样本更多情况下是活检小标本。因此，针对这类标本的EGFR突变检测，选用以上哪种方法更为合适，具有更高的临床指导作用。本研究重点探讨了当前EGFR基因突变检测工作中应用较为广泛的两种方法—直接测序法和ARMS法针对不同组织样本检测结果的差异。结果发现，ARMS法检测EGFR基因突变的总阳性率略高于直接测序法，尤其对于纤维支气管镜活检、经皮肺穿刺活检等小样本，差异更为显著。但对于手术切除等大样本而言，二者检测结果差异无统计学意义。本研究结果与赵婧雅等研究结果基本一致[6]。

由于正常细胞对肿瘤细胞EGFR基因突变信号具有抑制作用[7]，检测肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被直接测序法有效检出[8]。肿瘤组织样本中往往混有部分，甚至大部分非肿瘤成份，因此，直接测序法检测EGFR基因突变的灵敏度较低。而以荧光定量PCR技术为基础的ARMS法，其特异性探针仅识别并扩增EGFR突变序列，使得突变信号的收集过程较少受到肿瘤组织中混杂的成份的干扰。基于ARMS法的高选择性及高灵敏性，即使肿瘤组织突变含量低至1%也能被其检出。由于活检小标本所含肿瘤细胞数量较少，且比例普遍偏低，导致两种方法检测EGFR基因突变在结果上差异性更为显著。

总而言之，本研究结果提示，对于手术切除大样本，直接测序和ARMS法均可有效检出EGFR基因突变状态，但对于小活检标本应选用灵敏度相对较高的ARMS法，从而降低假阴性率，使更多患者能及时获得EGFR-TKI靶向治疗。

[1] MITSUDOMI T,MORITA S,YATABE Y,et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2010,11(2):121-128.

[2] MAEMONDO M,INOUE A,KOBAYASHI K,et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J].N Engl J Med,2010,362(25):2380-2388.

[3] ZHENG R,ZENG H,ZHANG S,et al.National estimates of cancer prevalence in China,2011.Cancer Lett,2016,370(1):33-38.

[4] JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[5] SHI Y,ZHANG L,LIU X,et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer (ICOGEN):a randomised,double-blind phase 3 non-inferiority trial.Lancet Oncol.2013，14(10):953-961.

[6] 赵婧雅，王笑影，曾海英，等.直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统检测肺癌小活检标本EGFR基因突变的比较[J].中国癌症杂志，2013，23(2)：106-113.

[7] ELLISON G,DONALD E,MCWALTER G,et al.A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:132.

[8] LI J,WANG L,MAMON H,et al.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing[J].Nat Med,2008,14(5):579-584.

Comparison of direct sequencing and fluorescence quantitative PCR for EGFR mutations detection in Non-small cell lung cancer

MINSheng-ping.(DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine.ThefirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege)

Objective：To compare the differences between fluorescence quantitative PCR and direct sequencing of detecting EGFR mutations in non-small cell lung cancer.Methods:Both direct sequencing and fluorescence quantitative PCR (amplification refractory mutation system, ARMS) were used to detect EGFR mutations in exon 18, 19, 20, and 21 in 155 formalin-fixed and parrffin-embeded (FFPE) NSCLC specimens,and the differences between the two methods were analyzed.Results:In 80 surgical excision samples, EGFR mutations were identified in 25 cases with a mutation rate of 31.5% by direct sequencing, and in 28 cases with a mutation rate of 35% by ARMS, showing no statistical differences in the two detections(P>0.05). In 75 biopsy specimens, EGFR mutations were identified in 19 cases with a mutation rate of 25.33% by direct sequencing, while in 26 cases with a mutation rate of 34.67% by ARMS. There were significant differences of EGFR mutation rate between the two methods(P<0.05).Conclusion:Both direct sequencing and ARMS can effectively identify EGFR mutation in surgical excision samples, but in biopsy specimens, ARMS gains a higher sensitivity than direct sequencing in detection of EGFR mutation.

Cancer,non-small celllung; NSCLC; EGFR; Gene mutation; Direct sequencing; Fluorescence quantitative PCR

蚌埠医学院第一附属医院 呼吸与危重症医学科,安徽 蚌埠 233040

闵生萍(1980-)，女，检验师，大学。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2016.06.002

R 734.2

A

1008-7044(2016)06-0633-03

2016-09-12)