骨髓增生异常综合征去甲基化治疗后血小板减少的中药疗效探讨

贾新颜，杨文忠，沈桢巍，宗　明，马建伟，丁媛媛，甘欣锦

骨髓增生异常综合征去甲基化治疗后血小板减少的中药疗效探讨

贾新颜1，杨文忠1，沈桢巍1，宗明1，马建伟1，丁媛媛1，甘欣锦2

目的:观察骨髓增生异常综合征(MDS)去甲基化治疗后血小板减少的中药疗效。方法:将39例MDS去甲基化治疗后血小板减少患者随机分成两组，对照组采用常规方法(止血敏、输注单采血小板)治疗，中药组在对照组基础上加服补肾健脾止血中药治疗，检测血小板计数、血小板减少持续时间、血清IL-11水平、骨髓单个核细胞IL-11受体α基因的表达与变化。结果:与对照组比较，中药组治疗后15 d血小板计数明显升高达（101.3±16.2）×109/L，血小板减少持续时间缩短为（12.2±2.0）d、血小板输注量减少至17 U；2组血清中IL-11水平及骨髓单个核细胞IL-11受体α基因的表达两组之间无明显差异。结论:MDS去甲基化治疗后配合补肾健脾止血中药，可以减轻出血症状、加快血小板恢复，减少血小板输注。

骨髓增生异常综合征；去甲基化；中药；血小板减少

去甲基化药物DNA甲基化转移酶抑制剂-地西他滨是骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)的主要治疗手段，骨髓抑制是最常见的毒副反应,其中血小板的显著减少直接威胁患者生命。常需减量应用或被迫中断或延误治疗，在一定程度上削弱了药物对病变细胞的彻底清除，影响了缓解率及长期无病生存率[1]。我们于2013年10月—2015年2月，对上海市东方医院住院的39例MDS患者,采用口服补肾健脾止血中药治疗，取得良好疗效，现报道如下。

1　资料与方法

1.1临床资料本组共39例，经骨髓细胞学检查、骨髓病例活检、染色体及骨髓细胞簇分化抗原检测，有明确的病理诊断[2]。分型根据2012年专家共识[3]。将39例患者采用用系统随机双盲法分为对照组18例和中药组21例，2组性别、年龄及诊断分期无显著统计学差异,见表1。

表1　两组MDS患者临床特征比较(n，%)

1.2治疗方法对照组常规使用地西他滨去甲基化治疗，用止血敏、安络血等，部分血小板＜50× 109/L且出血倾向严重者输注血小板悬液。中药于使用地西他滨治疗当天开始加用补肾健脾止血中药：黄芪30 g，当归10 g，枸杞子10 g，菟丝子10 g，女贞子10 g，仙鹤草30 g，茜草10 g。随证加减，1剂/d。煎药机水煎2次，上下午温服。高热则停用本方。余同对照组。

1.3观察指标 （1）参照血小板减少程度评价标准[4]评价两组治疗前和治疗后15 d外周血血小板减少的程度。Ⅰ度：(75～100)×109/L；Ⅱ度：(50～75)×109/L；Ⅲ度：(25～50)×109/L；Ⅳ度：＜20×109/L；Ⅴ度：死亡。（2）观察治疗前和治疗后15 d出血症状，包括口腔皮肤黏膜出血、牙龈出血、鼻衄、月经量过多，甚至消化道、呼吸道、颅内出血等。

1.4检测方法 （1）采用ELISA方法、IL-11 Quantikine酶联免疫试剂盒（美国R&D公司）检测治疗前后血清IL-11水平。（2）血清IL-11R水平检测：主要试剂为TRIzol试剂，购自Invitrogen公司。逆转录SuperScript TMⅢ First-strand购自Invitrogen公司、Taq DNA聚合酶购自TARAKA公司、荧光定量PCR采用试剂为SYBR Premix Ex TaqTM。引物为Invitrogen公司合成,照文献[5]设计,序列如下：IL-11Rα-1∶5'-CCGGATTAATGTGACTGAGGTG-3'；IL-11Rα-2: 5'-GTAGCCGAGGGTGTGGTTGGAG-3'。

全血单个核细胞（MNC）分离：常规抽取全血5 mL，EDTA抗凝,用淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)分离MNC加TRIzol总RNA提取液1 mL，混匀后-80℃冻存(时间小于2个月)用于RNA制备。RNA提取及定量采用TRIzol一步法：提取MNC总RNA,紫外分光光度仪测定260，280 nm吸光值(A)，计算RNA含量。cDNA合成：按照试剂盒说明书进行操做，完成40个循环。选择GAPDH作为内参照：GAPDH: IL-11Rα-1∶5'-GTGTCCAGCC TGAATTCCACT-3'，GAPDH:IL-11R α-2∶5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

PCR扩增反应体系相同。PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，EB染色，分析鉴定。原始模板浓度=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct-CtGAPDH。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件对所有数据进行统计学分析,计量资料以均数±标准差表示,计数资料采用95%可信区间的估计以及进行卡方检验及t检验，检验水准为双侧检验。

2　结果

2.1出血中药组发生出血9例，其中6例为Ⅰ～Ⅱ级皮肤黏膜出血，3例为口腔出血。对照组发生12例，其中9例为Ⅰ～Ⅱ级皮肤黏膜出血，3例为鼻腔口腔出血。无Ⅲ～Ⅳ级出血情况。2组出血发生率和出血程度对比均有统计学差异(χ2=5.321，P＜0.05)。

2.2血小板计数中药组血小板计数明显高于对照组组（P＜0.05），血小板减少持续时间、输注血小板总量均低于对照组（P＜0.05）。见表2。

2.3血清IL-11水平2组治疗前后血清IL-11水平比较，差异无明显统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.4骨髓中单个核细胞IL-11αmRNA表达水平

中药组IL-11Rα基因表达水平(1.25±0.31)，与对照组(1.07±0.22)比较无明显差异(P＞0.05，见图1)。

表2　两组患者治疗前后血小板相关参数比较(±s)

表2　两组患者治疗前后血小板相关参数比较(±s)

注：与对照组组相比，aP＜0.05

组别中药组对照组n 21 18治疗前（×109）57.67±14.3 55.8±12.7治疗后（×109）101.3±16.2a85.4±12.7血小板减少持续时间（d）12.2±2.0a17.1±1.8血小板输注总量（U）17a 27

表3　两组患者治疗前后血清IL-11水平比较（±s，pg/mL）

表3　两组患者治疗前后血清IL-11水平比较（±s，pg/mL）

组别中药组对照组n 2 1 1 8治疗前8 . 0 8 ± 1 . 5 7 . 9 7 ± 1 . 7 1治疗后1 0 . 1 4 ± 1 . 1 5 7 . 2 2 ± 1 . 5 8

图1 骨髓中单个核细胞IL-11αmRNA相对定量PCR扩增及溶解曲线

骨髓中单个核细胞IL-11αmRNA相对表达量中药组为0.23，对照组为0.31，二者比较无明显差异(P＞0.05)。

2.5不良反应中药组不良反应为轻度恶心、胃部不适、大便干结等，对症处理后很快好转，未见心、肝肾等脏器损伤。

3　讨论

去甲基化药物—地西他滨是美国FDA最早认证的能有效治疗和延缓MDS疾病进展的药物，是目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，阻断DNA甲基化可致基因激活与诱导细胞分化[6-7]。但去甲基化治疗后骨髓抑制所致的血小板减少，是威胁MDS患者生命的一个十分严重的并发症,常采用的输注血小板悬液或细胞因子等治疗，均受到各种限制而难以达到有效的血小板水平，从而极大限制了去甲基化药物的使用[8-9]。

中医认为，MDS以肝郁、脾虚、肾亏为本，气血阴阳亏虚为先，肝郁气滞，继则邪毒内壅，气血滞行，终致虚实夹杂。大量临床药理证实[10]，健脾补肾中药有促进骨髓干细胞和早期细胞增殖分化、自我复制的作用，中医中药通过整体辨证施治，可改善造血刺激因子和造血抑制因子的失衡，减少造血祖细胞凋亡，促进早期造血细胞增殖、分化的作用并减少治疗后感染、出血等并发症。我们查阅了近10年来国内所有杂志上发表的关于去甲基化后血小板减少的方剂，并以2006年以后的为主，从中筛选出31首最典型的方剂[11-12]。经过统计，此31首方剂一共主要使用了50多种药物，我们参照辨证，并结合其中最常见的用药，设基本方为黄芪、当归、枸杞子、菟丝子、女贞子、仙鹤草、茜草。并随证加减。本方中女贞子滋阴补肾;茜草、仙鹤草凉血止血；黄芪、当归补气以生血;甘草调和诸药;共奏健脾益气填精、化瘀止血之功[13-14]。希望能通过刺激正常残存造血干/祖细胞，从而提高血细胞数量，早日摆脱输注血小板，提高生活质量。

白介素-11（IL-11）可刺激原始干细胞扩增及向定向干细胞分化，促进骨髓红系、粒系、淋巴系、巨核细胞系的生成。并与上调骨髓细胞IL-11αmRNA的表达水平、增强巨核细胞增殖活化信号相关[15]。早期及晚期巨核系祖细胞和各期巨核细胞均有IL-11受体α链的表达[16]。我们使用补肾健脾止血法治疗39例甲基化治疗后的MDS患者。结果显示，与对照组比较，虽然血清IL-11水平变化及骨髓中单个核细胞IL-11αmRNA相对转录水平较治疗组略升高，但无明显统计学意义。使用该法治疗患者，血小板恢复时间加快、血小板减少持续时间缩短、血小板输注频率和输注量明显减少（P＜0.05）。且该方法不良反应轻微,经对症处理后很快好转。提示健脾益肾法治疗MDS去甲基化治疗后血小板减少副作用，具有良好的有效性和安全性。

研究证明，本法治疗MDS去甲基化治疗后血小板减少，可以改善出血症状，减少输注血小板数量，促进骨髓增生，有促进造血细胞增殖，并且副作用轻微，是治疗MDS血小板减少的中西医结合的一种新方法。

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（收稿：2016-01-26修回：2016-05-20）

（责任编辑刘洪斌）

Effect of Traditional Chinese Medicine on Thrombocytopenia after Demethylation of Myelodysplastic Syndrome

JIA Xin-yan,Yang Wen-zhong,Shen Zhen-wei,et al.Shanghai East Hospital,Tongji University, Shanghai(200120),China

ObjectiveTo study the effect of traditional Chinese medicine for thrombocytopenia patients af⁃ter the treatment of myelodysplastic Syndrome(MDS)demethylation.MethodsThirty-nine patients diagnosed with thrombocytopenia after the treatment of MDS demethylation were randomly divided into two groups.The con⁃trol group was treated with conventional methods(dicynone,single donor platelets infusion);While the traditional Chinese medicine group was treated basing on conventional methods,traditional Chinese medicine with curative effect of invigorating the kidney and reinforcing spleen and hemostasis.The purpose of the research is to detect the expression and changes of the platelet count,platelet reducing duration,serum level of IL-11,bone marrow mononuclear cells IL-11 receptor alpha gene.ResultsCompared with control group,after treatment of tradi⁃tional Chinese medicine for 15 days,the platelet count significantly increased to（101.3±16.2）×109/L,the plate⁃let reducing duration decreased to（12.2±2.0）d，the volume of platelet transfusion decreased to 17 u.The ex⁃pression level of serum IL-11 and bone marrow mononuclear cells(IL-11 receptor alpha)gene showed no obvi⁃ous difference between the two groups.Conclusion Posttreatment of MDS demethylation combined with tradi⁃tional Chinese medicine which has invigorating the kidney,reinforcing spleen and hemostasis effect can reduce bleeding symptoms,accelerate the platelet recovery and reduce platelet transfusion.

Myelodysplastic Syndrome;demethylation;traditional chinese medicine;thrombocytopenia

R551.3

A

1007-6948(2016)03-0249-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.011

浦东新区社发局资助项目(PW2013A-1)

1.上海市东方医院同济大学附属东方医院血液科（上海200120）

2.上海中医药大学附属龙华医院血液科（上海 200320）

甘欣锦，E-mail:ganxinjin11@163.com