利用大型蚤和斑马鱼评价腈纶废水好氧-厌氧处理过程的急性毒性和遗传毒性变化

杨京亚，赵璐璐，张洲，刘薇,*，张新，徐晓晨，涂响

1.大连理工大学环境学院工业生态与环境工程教育部重点实验室，大连116024

2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京100012

利用大型蚤和斑马鱼评价腈纶废水好氧-厌氧处理过程的急性毒性和遗传毒性变化

杨京亚1，赵璐璐1，张洲1，刘薇1,*，张新1，徐晓晨1，涂响2

1.大连理工大学环境学院工业生态与环境工程教育部重点实验室，大连116024

2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京100012

腈纶废水毒性较强且难以去除,对腈纶废水毒性及污水处理过程毒性削减能力进行评价,可为开发该类废水毒性减排技术提供科学依据。利用大型蚤及斑马鱼评价某腈纶废水的急性毒性和遗传毒性,及厌氧-好氧工艺对该废水毒性的削减能力。采用大型蚤活动抑制率和斑马鱼致死率表征废水急性毒性,采用斑马鱼肝细胞彗星尾矩表征废水遗传毒性。腈纶废水处理前对大型蚤和斑马鱼的急性毒性单位(TU)分别为1.2和2.9,经厌氧-好氧工艺处理后分别降至＜0.4和0.5。遗传毒性结果表明腈纶废水对斑马鱼肝细胞造成DNA损伤作用,经处理后遗传毒性仍显著高于阴性对照组。理化指标与毒性指标相关性分析表明,该废水氨氮与毒性显著相关,推测氨氮可能是该废水中的重要致毒因子之一。研究结果表明该腈纶废水采用现有厌氧-好氧工艺无法有效削减毒性,对受纳水体水生态环境造成潜在危害。

腈纶废水；大型蚤；斑马鱼；急性毒性；遗传毒性

腈纶废水是一种典型有毒废水,对微生物有显著抑制作用,难生物降解[1]。其中干法腈纶在生产过程中先后加入二甲基甲酰胺、丙烯腈、四乙酸二氨基乙烷和壬基酚聚氧乙烯醚等20余种原料,并且在聚合反应中又生成不同分子量的聚丙烯腈,因此腈纶废水中污染物含量多,且有机胺和氨氮含量高[2-3]。我国对废水排放的水质评价与监督以理化分析为主,难以反映废水中多种组分的综合毒性效应[4]。废水生物毒性监测,能弥补理化指标监测的不足。有研究者利用蚕豆根尖微核试验、小麦发芽试验、发光菌急性毒性试验、斑马鱼急性毒性试验分析腈纶工业废水的急性毒性和遗传毒性,结果表明腈纶废水毒性较强,排入水体会对当地水生态系统乃至人类健康造成一定的危害[5-6]。

辽河流域主要污染物排放量远远超过受纳水体环境容量,废水的排放会增加区域环境负荷[7],其中化工和石化废水是辽河流域重要污染来源之一。辽河流域化工与石化行业有机污染特征分析表明,典型企业排水与受纳水体间存在明显的源-汇响应关系[8]。因此,对代表性腈纶废水进行毒性评价,及污水处理过程毒性削减能力进行评价,对于辽河流域化工与石化废水污染控制具有重要意义。

大型蚤和斑马鱼是废水毒性评价国际通用模式生物,其中斑马鱼70%的基因与人类基因直系同源[9],采用斑马鱼肝细胞彗星实验对废水遗传毒性进行评价,有利于预测废水对高等脊椎动物乃至人类健康的潜在危害[10]。本研究采用大型蚤、斑马鱼作为指示生物,对比分析了抚顺市某石化腈纶企业排水的急性毒性和遗传毒性特征,以及厌氧-好氧生化处理工艺对该废水毒性的削减能力,可为开发腈纶废水毒性减排技术提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试剂

氢氧化钠(NaOH)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、正常融点琼脂糖(NMA,1.2%)、低熔点琼脂糖(LMA,1.0%)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司。Gelred染液购自美国Biotium公司。实验试剂均为分析纯。

细胞裂解液:将2.5 mol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Tris、100 mmol·L-1Na2EDTA溶解后,用NaOH调节pH=10,置于4℃下备用。用前按体积比加入10%DMSO、1%Triton X-100。

电泳液:1 mmol·L-1Na2EDTA,300 mmol·L-1NaOH等体积混合,pH=13,4℃下保存。

1.1.2 仪器

光学显微镜(YS100,Nikon,日本)；TDZ4-WS低速台式自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；O-lympus IX71倒置式荧光显微镜(日本)。

1.1.3供试水样

取自抚顺某石化公司腈纶厂污水处理设施,该厂采用干法腈纶生产工艺,废水处理采用厌氧-好氧工艺:经调节池混合后进入厌氧系统,出水进入一沉池沉淀,上清液化学氧化处理后在二沉池内混凝沉淀,后经流化床、硝化处理进入三沉池,出水经生物碳塔吸附处理后排放。本研究采集入水、厌氧池、沉淀池出水和最终排放水。水样采集后,过滤除去悬浮颗粒物,测定水质常规理化指标(见表1),毒性测试前置于4℃保存,1周内进行毒性实验。毒性测试过程中,水中溶解氧＞4mg·L-1,pH为6～8。

1.2 急性毒性试验

大型蚤(Daphnia magna)购自大连海洋大学生命科学学院重点实验室,采用6～24 h内新出生的小蚤,暴露24 h后,记录不活动蚤数。预实验后确定5个浓度梯度,同时设置空白对照。每个样品设3个平行,每个样品投放5只大型蚤。

斑马鱼(Danio rerio)购自大连市花鸟市场,曝气去氯自来水中驯化1周,期间自然死亡率不超过5%,试验前1天停止喂食。预实验后确定5个浓度梯度,同时设置空白对照。每个样品设3个平行,每个样品1.2 L水,投放5条鱼,低于1克鱼/升水。静态方式染毒96 h后,记录存活的斑马鱼数目。

腈纶废水对大型蚤、斑马鱼急性毒性的评价采用半数效应浓度(EC50)和毒性单位(TU)。EC50表示腈纶废水使大型蚤行为抑制率或斑马鱼死亡率达到50%时所对应的浓度。TU=1/EC50。若当受试生物暴露于未稀释废水,急性毒性效应未达到50%,无法得到EC50,TU通过以下公式计算[11]:

TU=死亡率(行为抑制率)×100×0.02

本研究中急性毒性检出限是20%,因此当急性毒性为20%时,TU=0.02×100×20%=0.4。当未稀释水样的急性毒性低于20%时,TU值用＜0.4表示。

1.3 斑马鱼彗星实验

采用单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)实验,也称彗星实验(comet assay),在单细胞水平上检测DNA损伤[12]。每个平行测定样品采集3条斑马鱼肝脏,混合制备肝细胞悬液。采用双层凝胶结构制作电泳胶板,加入细胞裂解液裂解90 min,加电泳液使DNA解旋、电泳,后用Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液浸泡中和。晾干后用Gelred染色,倒置荧光显微镜观察,在自动曝光条件下拍照获取彗星图像。以尾矩(tail moment,TM,即彗尾长度和尾部DNA含量的乘积)为指标反映暴露于废水的斑马鱼肝细胞DNA损伤程度[13]。使用Casp软件随机抓取50个细胞图像测定尾矩,结果用(平均值±标准差)表示。

1.4 质量控制/质量保证

毒性实验采用空白对照、阳性对照、平行测定作为质控措施。采用重铬酸钾(K2Cr2O7)作为急性毒性试验的阳性对照物,K2Cr2O7对大型蚤活动抑制和斑马鱼致死作用的EC50分别为(0.7±0.1)mg·L-1和(293±16)mg·L-1。遗传毒性实验采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)作为阳性对照物。空白对照组彗星尾矩为(1.0±0.5),暴露于1μg·L-14-NQO时,彗星尾矩为(7.0±2.2)。

1.5 数据处理

利用SPSS19.0进行统计分析。采用probit analysis计算EC50。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间差异检验。采用Pearson分析考察理化指标与毒性指标之间的相关性。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 水质基本理化指标

腈纶废水的理化参数测定结果可见表1。进水、厌氧池及初级淀池出水COD及氨氮浓度较高,后经化学氧化、二级沉淀、流化床处理后,出水COD和氨氮显著降低。三沉池出水COD有所升高,原因可能有污泥指数高等。最终出水理化指标除氨氮外,达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918—2002)的一级标准,厌氧-好氧生化处理工艺对该腈纶废水 COD、氨氮的去除率分别为81.6%和57.7%。

表1 污水处理厂各反应段出水的水质指标Table 1 Quality index of wastewater from sewage treatment process

2.2 腈纶废水对大型蚤和斑马鱼的急性毒性

腈纶废水不同处理工艺段出水对大型蚤的活动抑制作用和对斑马鱼的致死作用结果见表2。腈纶废水未经处理前对大型蚤和斑马鱼具有明显的急性毒性,暴露于原水造成大型蚤活动抑制率和斑马鱼死亡率为100%,TU分别为1.2和2.9。经过厌氧-一沉/二沉处理后,急性毒性没有明显变化。处理至流化床,急性毒性显著降低。最终出水未发现大型蚤的活动抑制作用,对斑马鱼表现出轻微的致死作用。

图1 阴性对照、腈纶废水进水、出水的斑马鱼肝细胞彗星图像(×100)注:(A)阴性对照,(B)进水,(C)出水。Fig.1 Comet images of hepatocyte collected fromDanio rerioexposed to negative control,influent and effluent of acrylic fiber wastewaterNote:(A)Negative control,(B)Influent,(C)Effluent.

图2 腈纶废水进水、出水在不同稀释度下对斑马鱼造成的DNA损伤注:(A)进水,(B)出水；**代表与对照组相比P＜0.01。Fig.2 DNA damage in the hepatocytes ofDanio rerioafter exposure to effluents from the typical process stages of acrylic fiber industry at different concentrationsNote:(A)Influent;(B)Effluent.** represent significant differences atP＜0.01,compared with control values.

表2 腈纶废水进水及不同工艺段出水对大型蚤和斑马鱼的急性毒性Table 2 Acute toxic effects onDaphnia magnaandDanio rerioexposed to acrylic fiber wastewater influent and effluents from different treatment units

2.3 腈纶废水对斑马鱼的遗传毒性

代表性对照和废水作用于斑马鱼肝细胞的彗星图像见图1。对照组细胞尾矩为(1.0±0.5)(图2)。随着暴露稀释梯度的升高,腈纶废水不同工艺段出水对斑马鱼肝细胞造成的DNA损伤程度增加,暴露在腈纶废水原水5%稀释梯度下对斑马鱼肝细胞造成的DNA损伤的彗星尾矩为(19.2±3.4),较对照组呈极显著差异(P＜0.01)；而出水10%稀释梯度下对斑马鱼肝细胞造成的DNA损伤尾矩为(3.6±1.3),较对照组呈极显著性差异(P＜0.01)。

3 讨论(Discussion)

本研究选择大型蚤及斑马鱼为受试生物,对腈纶废水的毒性进行评价。结果表明腈纶废水对大型蚤和斑马鱼产生明显的急性毒性作用,并对斑马鱼肝细胞产生DNA损伤作用。大型蚤和斑马鱼作为浮游动物和脊椎动物的代表,其毒性测试结果对于废水的潜在生态危害具有重要指示作用。经过厌氧-好氧生化工艺处理后,腈纶废水的COD、氨氮及毒性降低,且单位COD的急性毒性降低,表明处理过程中强毒性物质被降解为低毒物质,该工艺对急性毒性和遗传毒性具有一定的削减能力。但最终出水仍具有显著的遗传毒性,表明该废水经处理后虽然毒性显著降低,但对于水生态系统仍存在一定风险。张凯等[5]发现丙烯腈模拟废水经Fenton、活性炭吸附、加成法处理后,对小麦的毒性降低,但对发光菌的毒性升高,提示该类废水毒性削减难度较大。

单细胞凝胶电泳(彗星实验)应用于检测污染物对DNA造成的损伤程度[12],DNA损伤是指由化学或物理因素引起的DNA链断裂、分子机体修饰和DNA交联等,若这种损伤没有得到及时的修复,就会引起突变,乃至癌变[13]。该腈纶废水氨氮、COD均与遗传毒性显著相关(P＜0.05),表明遗传毒性是该腈纶废水的重要毒性特征,废水中的主要成分能引起DNA损伤。Chang等[14]研究表明丙烯腈可引起原代培养的成人支气管上皮细胞DNA单链断裂。丙烯腈及其代谢产物可损伤生物膜,产生活性氧攻击DNA大分子,造成DNA损伤,使小鼠精细胞DNA产生交联作用[15]。有研究表明,二甲基酰胺在有氧的条件下会降解产生H2O2,且会导致DNA的损伤[16]。

此外,该腈纶废水氨氮与急性毒性也显著相关(P＜0.05),推测氨氮是造成腈纶废水对水生生物产生毒性作用的关键致毒因子之一。当水中氨氮浓度超过25mg·L-1时,会对水体生态环境产生严重风险[17]。已有研究表明,氨氮对大型蚤和斑马鱼急性毒性的 LC50分别为 165.97mg·L-1和 101mg·L-1[19-20]。与本研究中腈纶废水经在氨氮为30.7mg·L-1下对斑马鱼产生轻微致死效应的结果相近。氨氮对水生动物的急性毒性主要是非离子氨的作用,非离子氨通过细胞膜进入血液后转化为NH+4,使神经元去极化,最终导致细胞死亡,即使是在剂量较低的情况下,也能对鱼类神经系统产生影响[18]。腈纶废水毒性鉴别仍需进一步研究,以确定废水中的有毒有害污染物,有助于实现污染物源头控制。

[1]安鹏,徐晓晨,杨凤林,等.臭氧/紫外协同作用处理腈纶废水[J].土木建筑与环境工程,2011,33(1):135-139 An P,Xu X C,Yang F L.Progress in wastewater treatment of dry-spun PAN fiber[J].Journal of Civil Architectural&Environmental Engineering,2011,33(1):135-139 (in Chinese)

[2]李长波,赵国峥,邱峰,等.A/O-MBR改进工艺处理干法腈纶废水的启动研究[J].环境科学与技术,2014,37 (6):135-139 Li C B,Zhao G Z,Qiu F,et al.Starting-up research of improved A/O-MBR technology for treating dry acrylic fiber wastewater[J].Environmental Science&Technology,2014,37(6):135-139(in Chinese)

[3]王烨,蒋进元,周岳溪.Fenton法深度处理腈纶废水的特性[J].环境科学研究,2012,25(8):911-915 Wang Y,Jiang J Y,Zhou Y X,et al.Charactristics of Fenton processin advanced treatmentofacrylic fiber wastewater[J].Research of Environmental Sciences, 2012,25(8):911-915(in Chinese)

[4]马梅,王毅,王子健.城市污水生物处理过程中有毒有机污染物浓度及毒性变化的规律[J].工业水处理, 1999,19(6):9－12 Ma M,Wang Y,Wang Z J.Variation in the composition, concentration and toxicity of organic pollutants in municipal sewage wastewater treatment process[J].Industrial Water Treatment,1999,19(6):9－12(in Chinese)

[5]张凯,唐景春,吴颖,等.丙烯腈废水及几种处理工艺出水的毒性[J].环境工程学报,2014,8(7):2809-2816 Zhang K,Tang J C,Wu Y,et al.Toxicity of acrylonitrilewastewater and several effluents from different treatment processes[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2014,8(7):2809-2816(in Chinese)

[6]孙晓怡,王毓军,巩宗强,等.抚顺市工业废水生物毒性评价[J].生态学杂志,2006,25(5):546-549 Sun X Y,Wang Y J,Gong Z Q,et al.Biological toxicity of industrial wastewater in Fushun,Liaoning Province[J]. Chinese Journal of Ecology,2006,25(5):546-549(in Chinese)

[7]孟伟.辽河流域水污染治理和水环境管理技术体系构建——国家重大水专项在辽河流域的探索与实践[J].中国工程科学,2013,15(3):4-10 Meng W.Construction of technology system for watershed water pollution treatment and management—Exploration and practice of the major water program in Liaohe River basin[J].Engineering Sciences,2013,15(3):4-10 (in Chinese)

[8]张林林.辽河流域化工与石化行业有机污染特征及风险评价[D].北京:北京交通大学,2014:53-56 Zhang L L.Organic pollution characteristics of Liaohe River chemical and petrochemical industries and risk assessment[D].Beijing:Beijing Jiaotong University,2014: 53-56(in Chinese)

[9]Howe K,Clark M D,Torrojia C F,et al.The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome[J].Nature,2013,496:498－503

[10]王佳佳,徐超,屠云杰,等.斑马鱼及其胚胎在毒理学中的实验研究与应用进展[J].生态毒理学报,2007,2 (2):123-135 Wang J J,Xu C,Tu Y J,et al.Experimental research and application of zebrafish and embryos in toxicology[J].A-sian Journal of Ecotoxicology,2007,2(2):123-135(in Chinese)

[11]高磊,李兆利,陈辉辉,等.染织排水对日本青鳉幼鱼和胚胎的毒性效应[J].生态毒理学报,2011,6(3):303－309 Gao L,Li Z L,Chen H H,et al.Toxicity of dye effluenton Japanese medaka(Oryzias latipes)embryo and larva [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2011,6(3):303－309 (in Chinese)

[12]Susanne B S,Andreas H,Stefan P,et al.The in vivo comet assay:Use and status in genotoxicity testing[J]. Mutagenesis,2005,20:245-254

[13]Lee R F,Steinert S.Use of the single cell gel electrophoresis/comet assay for detecting DNA damage in aquatic (marine and freshwater)animals[J].Mutation Research, 2003,544:43-64

[14]Chang C M,Hsia M T,Stoner G D.Acrylonitrile-induced sister chromatid exchanges and DNA single-strand breaks in adult human bronchial epithelial ceils[J].Mutation Research/Genetic Toxicology,1990,241(4):355-360

[15]崔金山,李海山,张淼.丙烯腈对DNA交联作用研究[J].中国工业医学杂志,2004,17(1):18-20

[16]Kaoru M,Mariko M,Shinji O,et al.DNA damage by dimethylformamide:Role of hydrogen peroxide generated during degradation[J].Chemical Research in Toxicology, 2000,13:309-315

[17]闫振广,孟伟,刘征涛.辽河流域氨氮水质基准与应急标准探讨[J].中国环境科学,2011,31(11):1829-1835 Yan Z G,Meng W,Liu Z T.Development of aquatic life criteria and lash-up standard for ammonia in Liao River basin[J].China Environmental Science,2011,31(11): 1829-1835(in Chinese)

[18]赵志刚,张志生,程杰,等.大型溞母溞暴露于氨氮所产子代对氨氮毒性的耐受性[J].环境科学研究,2011, 24(2):205-209 Zhao Z G,Zhang Z S,Cheng J,et al.Acute toxicity of ammonia to offspring ofDaphnia magnaborn by pregnant individuals during chronic exposure[J].Research of Environmental Sciences,2011,24(2):205-209(in Chinese)

[19]韩力强,康现江,李双石,等.氨氮对斑马鱼2种代谢酶类的影响[J].河北大学学报,2005,25(2):179-184 Han L Q,Kang X J,Li S S,et al.Effects of ammonia nitrogen on metabolic enzymes inBrachyclanio rerio[J]. Journal of Hebei University:Natural Science Edition, 2005,25(2):179-184(in Chinese)

[20]Randall D J,Tsui T K N.Ammonia toxicity in fish[J]. Marine Pollution Bulletin,2002,45(1):17-23

Variation in Acute Toxicity and Genotoxicity of Acrylic Fiber Wastewater on Daphnia magna and Danio rerio during Anaerobic－aerobic Treatment Process

Yang Jingya1,Zhao Lulu1,Zhang Zhou1,Liu Wei1,*,Zhang Xin1,Xu Xiaochen1,Tu Xiang2
1.Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering(MOE),School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology,Dalian 116024,China
2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment,Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China

24 March 2015 accepted 5 April 2015

The acrylic fiber wastewater exhibits relatively high toxicity,which is difficult to be removed.The evaluation for the toxicity of the acrylic fiber wastewater and its reduction during the treatment process would facilitate the improvement of toxicity removal when optimizing the wastewater treatment technique.Daphnia magnaandDanio reriowere applied to evaluate the acute toxicity and genotoxicity of acrylic fiber wastewater,and the toxicity removal by anaerobic－aerobic(A/O)treatment process.The acute toxicity of the acrylic fiber wastewater was tested byDaphnia magnaimmobilization andDanio reriomortality.The genotoxicity was evaluated by comet tailmoment ofDanio reriohepatocyte.The acrylic fiber wastewater samples were collected from a representative chemical industry located in Fushun,Liaoning Province.The removal of COD and ammonia by the A/O process were 81.6%and 57.7%,respectively.The COD and the ammonia of the effluent from the treatment process were 36.2 and 30.7mg·L-1,respectively,which fell within the“Discharge Standard of Pollutants for Municipal Wastewater Treatment Plant”in China.The wastewaters induced acute toxicity toDaphnia magnaandDanio rerio, with the acute toxicity units at 1.2 and 2.9 before treatment,＜0.4 and 0.5 after A/O treatment,respectively.Acrylic fiber wastewater caused DNA damage toDanio reriohepatocyte,and the genotoxicity of the effluent was still significantly higher than that of the negative control group.Correlation analysis between physiochemical indexes and toxicity indicator showed that ammonia concentrations were significantly correlated with the toxicity,suggesting that ammonia may be one important toxicity factor in the acrylic fiber wastewater.The results suggested that the current A/O treatment process was limited in remove the toxicity of the acrylic fiber wastewater,and the discharged wastewater would pose potential hazard to the aquatic ecosystems of the receiving water.

acrylic fiber wastewater;Daphnia magna;Danio rerio;acute toxicity;genotoxicity

2015-03-24 录用日期:2015-04-05

1673-5897(2016)1-225-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150324003

杨京亚,赵璐璐,张洲,等.利用大型蚤和斑马鱼评价腈纶废水好氧-厌氧处理过程的急性毒性和遗传毒性变化[J].生态毒理学报,2016,11(1):225-230

Yang J Y,Zhao L L,Zhang Z,et al.Variation in acute toxicity and genotoxicity of acrylic fiber wastewater onDaphnia magnaandDanio rerioduring anaerobic－aerobic treatment process[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):225-230(in Chinese)

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07202-002)

杨京亚(1990-),女,硕士,研究方向为水生态毒理学,E-mail:nearlyyang@163.com；

),E-mail:liu_wei@dlut.edu.cn

简介:刘薇(1980-)，博士，副教授，主要研究方向为环境污染物暴露评估、毒性效应和机理,发表学术论文30余篇。