OECD鱼类生物蓄积测试的优化策略研究

杨婧，刘敏，赵华清，邓芸芸，王绿平，张京佶，殷浩文

上海市检测中心，上海201203

OECD鱼类生物蓄积测试的优化策略研究

杨婧，刘敏，赵华清，邓芸芸，王绿平，张京佶，殷浩文*

上海市检测中心，上海201203

作为化学品风险管理中的重要环境行为参数,生物蓄积性不仅是分类、标签、评价和控制环境风险的基本指标,也是鉴别化学物质持久性和环境危害性的重要标准。2012年OECD颁布了新的生物蓄积测试方法,由此给生物蓄积优化策略带来了全新的挑战,原有的判别优化策略的方法需要作出新的发展与调整。针对新生物蓄积测试方法引发的优化策略挑战,通过层次研究及文献分析,归纳了基于OECD新305生物蓄积测试标准的优化测试策略,为优化、简化测试及化学品安全管理提供了科学基础。

鱼；生物蓄积；优化策略

目前,国际上主要采用的标准方法有经济合作与发展组织(OECD)的生物蓄积测试标准(OECD 305)、美国环境保护署(USEPA)1996年颁布的测定鱼类 BCF的指南草稿[1]以及美国试验材料协会(ASTM)2013年颁布的与OECD方法相似性极高的识别鱼类和海洋软体动物中生物富集性的标准[2],使用最广的为OECD 305标准,我国的化学品测试、评价与管理也主要依据OECD标准。

近35年间陆续颁布了3个不同版本的OECD 305标准,1981年版[3]及1996年版[4]与USEAP和ASTM标准类似,均以水暴露方式下的生物富集因子(bioconcentration factor,BCF)评价蓄积性。2012版OECD新305[5]标准则有较大变化,将更多动物福利、简化试验和节约成本的考虑体现在标准中,率先引入了摄食暴露这一不同暴露层面的生物蓄积测试方法,实验室获取BMF(生物放大因子,biomagnification factor)值也首次作为测试及评价终点列入标准。

新305标准的变化与发展,为尽可能多地获取化学品的生物蓄积数据提供了可能,同时,也给测试策略的优化及化学品安全管理带来了新问题及挑战。现有的鱼类生物蓄积性评估策略[6-11]均仅针对水暴露体系,尚无摄食暴露的优化策略。并且,上述策略均以“3R”原则为出发点,涵盖非试验方法、替代试验及动物试验等不同层次,未涉及测试技术层面的细化策略。因此,基于新305标准的测试技术层面的优化、不同暴露层面所获结果的评价与应用等诸多技术细节仍需明确。

针对上述问题与挑战,通过层次研究及文献分析,研究了生物蓄积性测试及评估主要流程中的技术细节及关键影响因素,明确了OECD新305方法技术操作层面的细化策略及替代评估方式的使用,归纳了基于OECD新305标准、侧重于测试技术层面的生物蓄积性评估策略,为优化、简化测试及化学品安全管理提供了科学基础。

1 前期数据的收集、分析与利用

蓄积性评估前的已有信息收集、分析及利用,对测试的优化及豁免具重要意义。GLP实验室获取的可靠试验数据为前期数据的首选,还可参照Klimisch原则[12]对其他试验数据的可靠性进行评价。此外,类似物的试验数据、物质/类似物的软件预测数据也具一定的参考性。

1.1 物质理化数据

需了解分子式及结构(如可能)、纯度、组分、辛醇水分配系数(Kow)、溶解性、稳定性(如挥发性、光解、水解及降解性)、吸附性等数据。logKow小于3或具有快速生物降解性的物质或组分,可直接豁免生物蓄积测试(见图1)。此外,上述信息有助于初步测试方案的形成,如具一定吸附性的物质,水暴露时可考虑容器的预饱和,或与挥发性或水溶解度极低的物质一样,考虑摄食暴露。

应注意,分子量、分子尺寸、Kow及溶解性等参数对化学品的蓄积行为有重要影响[13-15],可用于蓄积性预测及测试方案优化,但对于logKow≥3的物质,上述参数作为生物膜透性及豁免蓄积测试的依据仍需科学验证。由不断更新的文献可知,这些参数的生物膜透性/蓄积性判定临界值仍在不断修正与完善,尚未形统一标准[6,11,16-22]。随着研究深入,不断发现蓄积性与logKow相关性较低的物质(如多氯联苯类等)[23],建立在BCF与logKow间关系基础上的预测模型仍需根据日益增加的实验数据不断修正和调整。

1.2 物质的生物毒性及其他生物数据

毒性效应可能改变或影响受试生物的常规生理功能(如呼吸速率)而产生不可靠的BCF值,故生物毒性数据如鱼类急性毒性试验的LC50或长期试验的LC50、NOEC或LOEC等为试验浓度设计的重要信息。

一般认为,不能很快代谢转化的物质可能具生物蓄积潜能。模型研究认为,代谢率相对低的物质,即使具极强的疏水性(lgKow＞6),仍有可能极大影响蓄积性[24]。因此,在蓄积测试中了解物质的代谢信息,有利于试验结果的解释。具有一定代谢性的物质,可依其代谢程度选择豁免、简化或优化试验(见本文3)。

2 OECD新305标准中技术细节的不确定性与测试策略研究

标准中整合了完整水暴露、简化水暴露及摄食暴露等3种试验,从不同试验方法及暴露方式的大致适用范围和操作原则可知,不同试验方法/暴露方式的选择和使用并无绝对界限,仍存在技术细节上的不确定性。通过项目研究,逐一分析并明确了这些技术细节,形成了侧重测试层面的生物蓄积性评估策略(见图1)。

2.1 水暴露及摄食暴露方式的比较及选择

标准中不同暴露方式的选取主要依据为操作的难易程度,认为水暴露适用于logKow在1.5至6之间的多数物质,也可能适用于logKow＞6的物质,实际操作中,强疏水性物质(logKow＞5且水溶解度低于0.01～0.1mg·L-1)水暴露与水溶液化学分析的难度大大增加,故可考虑摄食暴露。但操作难易程度的衡量并无统一标准,尤其2种暴露方式均满足要求时如何选取,标准并未明确。

针对上述问题,比较了含雌二醇(E2)、二甲苯麝香(MX)及六氯苯(HCB)在内logKow4.0～6.1的物质水暴露及摄食暴露的结果:吸收阶段,水暴露下的鱼体吸收速率k1均高于摄食暴露鱼体的吸收速率,物质更易在鱼体达到吸收稳态。镍、铊的黑头软口鲦生物蓄积研究[26]、多溴联苯醚(logKow5.9～10)对钩虾[27]及雌二醇对金鱼的生物蓄积研究中[28]均发现相同的结果。

标准规定了摄食暴露的周期且未强制规定应达到物质的吸收平衡,因此,在有限的暴露周期内,摄食暴露获取的动力学 BCF(kinetic bioconcentration factor,BCFK)值很可能低于该物质水暴露下的BCF值。综上,认为试验操作及分析方法的精度满足试验要求、物质水暴露浓度能维持稳定时,应优先考虑水暴露方式。无法满足水暴露试验条件或疏水性极强、水暴露无法在60 d内达到一定体内浓度的物质,可考虑摄食暴露。

2.2 简化水暴露与完整水暴露方法及选择

标准中水暴露试验有常规水暴露及简化水暴露2种,后者以简化的小型试验(如减少取样点等)取代完整水暴露试验获取BCF数据。满足水暴露条件并可预测物质吸收及清除符合一阶动力学、logKow小于6或可能快速代谢的物质,通过简化水暴露有可能直接获取科学的BCF数据。

为进一步简化、优化水暴露试验,标准提出BCF值可能不受暴露浓度影响时(如高、低浓度BCF差异小于20%时),可仅设1个试验浓度组。标准还指出水暴露最初为非极性物质设计,此类物质通常设1个试验浓度即可。研究了logKow值在0.53～4.51之间不同物质的水暴露结果后发现:通常认为的非极性物质(logKow＞3的物质)[18,19],高、低浓度组间的结果差异最高可达1个数量级。可见,以常规的极性判定标准(logKow＞3)作为水暴露试验仅设1个试验浓度的依据并不充分。尤其在对物质信息知之甚少时,仅设1个试验浓度需慎重。

标准认为开展前期试验可能利于确定简化水暴露适用性,在简化水暴露试验中还指出:有时以超过1个浓度的简化水暴露试验作为前期试验确定BCF值是否受暴露浓度影响可能更具优势。可见,在对物质信息了解较少的情况下,需开展1个以上浓度的前期试验或简化水暴露试验确定简化水暴露适用性及浓度对BCF的影响。如开展前期试验,整个试验周期将长于单次试验。如简化水暴露不适用、简化水暴露中任何迹象表明物质与预测表现不同(如明显偏离一级动力学)、获得的动力学BCF值(BCFKderived from a minimised test,BCFKm)小于稳定阶段BCFSS的70%、简化试验的BCF值(BCFKm,BCFKm略小于BCFSS时用BCFss)超过500等,仍需进行完整水暴露试验。综上,物质信息了解有限时,从科学性与试验成本、周期和受试生物用量的角度综合权衡,直接进行1个以上浓度的常规水暴露试验更为可行。

此外,水暴露试验通常不推荐使用溶剂或分散剂,这类物质可能增加试验水中的有机碳含量进而显著影响流水试验中自由溶解物质的量,具快速生物降解性的溶剂(如丙酮)还可导致流水体系中细菌滋生。但溶解度极有限的物质(如低于0.1mg·L-1),使用助溶物质可能有助于获取水暴露所需的试验贮备液,但应注意,溶剂用量不可超过临界浓度(100mg·L-1或0.1 mL·L-1),不应显著改变受试物在试验体系中的溶解度(如显著高于其水溶解度),当鱼体对受试物生物利用度一定的时候,高于实际溶解度的试验浓度往往会导致错误的低估BCF值。

2.3 摄食暴露与结果判定

摄食暴露可避开水暴露中需面对的一些困难,包括在水暴露体系中各组分水溶性各异的多组分物质,但其测试终点为BMF,与水暴露终点BCF不具有直接可比性,并且,现有标准及相关管理法规中均未明确如何使用实验室获取的BMF值进行生物蓄积性判定。

野外数据的生物蓄积性判定标准通常为BMF＞1,但野外的BMF数据往往受水及摄食暴露双重暴露的影响,与标准试验条件下单纯通过摄食途径获取BMF值存在一定差异。有研究[28]比较了实验室条件下鲤鱼在9种低水溶性化学品暴露下脂肪校正后的BCF值(BCFL值)和BMF(BMFL值),除邻三联苯外(BCFL为810),其余物质的BCFL均超过1 000,管理上判定为具有生物蓄积性,但仅六氯苯及4,4'-亚甲基双(2,6-二叔丁基苯酚)的BMFL超过1,其余的BMFL值仅在0.03至0.4之间。综上,管理上如对实验室BMF值继续沿用BMF大于1的判定依据可能会低估一些物质的生物蓄积性。

图1 鱼类生物蓄积优化评估策略Fig.1 The optimized strategy for assessment of fish bioaccumulation

目前,尚无较系统的大数据研究建立实验室BCF值与BMF值的关联。因此,现阶段摄食暴露试验中,可尝获取动力学BCF值(BCFK),该数据有助于当下的化学品安全管理对物质蓄积性的判定。但应注意该数据适用于物质吸收或清除符合一级动力学方程的情况,并且需通过证据权重法衡量相关参数的适用性后方可用吸收速率常数k1估算BCF。随研究深入,通过数据积累建立实验室BCF数据与BMF数据间的关联后,有望明确并细化实验室BMF数据的蓄积性判定并运用于化学品的安全管理。

摄食暴露并非水暴露困难时的万能解决方案,该方法受饵料处理溶剂、饵料加标技术、定量化学分析方法以及相应的前处理方式等因素的限制。当水及摄食暴露均无法满足生物蓄积性评估要求时,可考虑其他替代评估方式(见本文3)。

2.4 化学分析方法的选择与方法适用性、精确度及准确性评价

化学分析技术及分析数据的质量直接影响暴露方式的选择及试验结果的准确性。标准指出分析方法需有适用性、精确度及准确性,但未列出判定依据,仅指出试验前期应建立化学分析方法并获得较高的回收率(比如,通常大于85%)。

通常,蓄积试验要求分析的样品涉及试验用水、鱼体和饵料3种成份差异较大基质,针对物质的不同,需采用不同的前处理方法。对于饵料和鱼体等相对复杂的基质,往往需增加必要的净化过程,常用有凝胶渗透色谱和固相萃取等。前者简单、自动化程度高,对蛋白质等大分子基质的净化作用较好,但对极性小分子化合物的净化能力不明显。后者可根据各物质的特性,针对性地选取净化柱、灵活选取各种试剂达到较好的净化效果,但过程复杂,目前自动化有限,需要操作者具有较好的专业背景。因此,分析方法的选择,需要在科学性及可操作性之间寻求平衡。

研究选取了10种logKow在0.53至6.2之间溶解性、挥发性及蓄积性各异的代表性物质,分别建立相应基质体系中的分析方法。涉及液相/气相色谱、液相/气相色谱-质谱等仪器分析手段,包括直接分析和液液萃取、加速溶剂萃取、超声萃取、固相萃取、凝胶净化等多种常规前处理方法,实现了不同介质中化学物质的特异性分析及高灵敏度检测。上述研究给出了分析方法适用性、精确度及准确性的基本评价依据:

(1)相关系数:气相色谱和液相色谱分析,相关系数R≥0.99；气相色谱-质谱和液相色谱-质谱分析,相关系数R≥0.95。

(2)回收率:方法的平均回收率范围 70% ～120%,理想状态为80%～110%。难分析样品,在精密度可接受范围内,可允许更低的回收率。

(3)精密度:通常,精密度RSD≤20%。特殊条件下,可接受更高的精密度值。

2.5 多组分物质生物蓄积性的简化测试思路

多组分物质一直是生态毒性测试中的难点。这类物质在试验前期可供试验设计参考的信息往往较少,难以像单一物质一样在早期形成简化/优化方案。组分明确的多组分物质,可从其lgKow＞3、不具生物降解性组分的水溶性及其水溶液稳定性的角度综合考虑,选择合适的试验暴露方式；组分不明的物质,如有合适的水暴露体系的制备及分析方式,仍可尝试水暴露,反之,则采用饵料暴露方式以避免不同组分水溶解性各异给定量分析带来的困扰。测试中,化学分析方法的适用性及灵敏性起着关键作用,为对多组分的物质的蓄积测试进行优化,可在试验前期进行包括水、饵料或溶剂中的物质稳定性在内研究以便优化试验设计。

2.6 生物蓄积测试结果的重要影响因素及控制

除试验方法/暴露方式选择和化学分析技术(见本文2.5节)外,试验鱼种的内在生物学特性也是蓄积性结果的重要影响因素。

不同的物质在鱼体组织中的浓度分布状况差异较大:不同抗生素因作用模式不同,在肌肉、消化组织、鱼胆、血浆及肝脏等不同部位均可能存在显著生物蓄积[14,21]。镉[22]在肾脏中的生物蓄积性大于肝脏、肠道、鳃及肌肉等组织,而卡马西平[29]及有机氯[30]则显著蓄积在不同鱼种的肝脏中。因此,在选取特定组织(如肌肉或肝脏)进行浓度分析前需对物质的组织分布有一定程度了解,选取代表性组织。对于小型鱼,取全鱼进行分析有利于获取真实、准确的生物蓄积性数据。

不同研究中物质的鱼体含量与性别的关系各异,有研究表明不同性别鱼体中铜[31]、镉[32]和汞[33-34]的含量有显著差异,也有研究表明铅、汞、镉和砷的鱼体含量与性别无关[35]。多氯联苯(PCBs)的生物蓄积研究[36]中也发现PCBs在肌肉中的浓度无显著性别差异,但雄鱼的PCBs浓度随鱼龄增加而增加,且在生命周期各阶段均有显著差异,而雌鱼的PCBs浓度则始终维持在一恒定水平。推测这种差异是雌鱼和雄鱼的生长速率及能量(食物摄入)需求不同所致。此外,雌鱼可能通过产卵将体内的PCBs浓度部分转移。鱼龄60 d至150 d的稀有鮈鲫及斑马鱼雌、雄鱼的差异研究也证实了上述推测,90 d日龄的稀有鮈鲫雌、雄成鱼体脂有显著差异。此外,雌鱼的体脂含量与体重相关性较好,而120 d以上雄鱼可能因精巢发育成熟后营养分配变化的原因致使体脂含量反而下降；性腺发育阶段120 d和150 d的斑马鱼雌、雄鱼体重差异显著。综上,可知性别对蓄积性影响的实质为不同性别的鱼(或处于生育阶段不同性别的鱼)生长速度、对能量的需求量各异致使体重、体脂等出现明显差异所致。因此,雌、雄个体差异较大的鱼种应尽量避免雌、雄鱼混用的测试方式；雌、雄个体差异较小的小型鱼种,繁殖期前、个体差异较小阶段,可混用进行测试。

物质的潜在生物蓄积性一般与其亲脂性有关,其BCF/BMF或在鱼体内浓度与脂肪含量有良好的正相关性[37,38]。相同鱼种及不同鱼种间因脂肪含量导致的BCF差异可达2至5倍[38-39]。因此,试验期间鱼体脂肪含量变化较大或使用自身脂肪含量较高的鱼种,脂肪校正非常必要。此外,暴露期间,可能存在因试验鱼生长、体重增加而导致物质在单位鱼体浓度降低的生长稀释现象,这种伪清除的过程致使过高估算k2(清除速率常数；d-1)从而低估动力学BCFk或BMFk。故可通过生长-校正清除速率常数(k2g)计算生长-校正生物放大因子或在在计算k2时以每尾鱼(整尾鱼为基础)所含化学物质的质量数据替代浓度数据以降低或避免生长稀释对结果的影响。近期一项不同鱼种甲基汞生物蓄积的大样本(约2 538个)调查发现,对不同体重、体长鱼进行标准化数据处理后,雌、雄鱼体内的甲基苯含量无显著性差异[40]。二甲苯麝香(MX)的稀有鮈鲫、斑马鱼及虹鳟(rainbow trout)的摄食暴露、六氯苯(HCB)的稀有鮈鲫、虹鳟及鲤鱼幼鱼摄食暴露,也发现经生长及脂肪校正后不同鱼种的BMFg(生长-校正生物放大因子)和BMFL(脂肪-校正生物放大因子)无显著差异。因此,为进一步减少个体差异对结果的影响,有必要对BCF/BMF结果进行生长及脂肪校正。

图2 生物蓄积性评价中的代谢研究策略Fig.2 The strategy of metabolism study during the assessment of fish bioaccumulation

3 生物蓄积性测试及评估的优化与替代评估方式

在测试前期或同期开展鱼体代谢研究有利于生物蓄积性评估的优化。获取代谢信息的途径有2种:(1)现有数据(包括已有的毒代动力学数据)收集、分析、文献检索或软件预测等；(2)在蓄积试验前期或试验期间开展代谢相关的试验研究。可借鉴药物代谢的研究手段,开展组织、细胞或亚细胞水平的体外或体内研究[41-45],还可从细胞响应、分子及蛋白水平的反应中筛选识别出与代谢相关的生物标识[46],揭示物质在鱼体中的代谢性。根据物质的代谢信息,豁免、中止或优化蓄积测试(见图2)。

对于受限于自身性质、试验条件等、难于开展生物蓄积测试的物质,可采用软件/模型预测(如生物蓄积性或毒代动力学软件/模型)、替代试验评估(如一些公认度较高的体内或体外评估方式)或文献调研等方式获取生物蓄积性的评估数据。

4 结论与展望

针对现有策略中测试层面及OECD新305标准中的技术不确定性进行研究,明确了物质(含多组分物质)不同试验方法/暴露方式的选择及优化测试原则:建议在可能的情况下,先考虑水暴露方式；前期信息较少时,直接进行1个以上浓度的完整水暴露试验；摄食暴露时,通过获取BCFSS或提供BCFK值(如适用)为现阶段的化学品分类及安全管理提供参考；明确了以分析方法标准曲线的线性相关系数、回收率和精密度评价方法适用性、精确度及准确性的方式及原则；为获取更准确的结果,建议选取代表性组织或全鱼(小鱼)进行化学分析,对BCF/BMF结果进行生长和脂肪校正。建议引入代谢研究以简化、优化或豁免试验,对于难于开展生物蓄积测试的物质,采用替代性评估方式获取蓄积性信息。通过上述研究及文献分析,形成了基于OECD新305标准的涵盖前期数据收集、分析与利用,生物蓄积优化测试策略,代谢性研究及替代评估方式等内容的鱼类生物蓄积优化评估策略。

随着后续研究的深入及数据的积累,还可对策略中的以下方面进行更为细化的补充:

(1)通过在摄食暴露中同时报道 BCFK或BCFSS,或通过对更多物质进行实验室条件下的BCF与BMF比较研究,建立BCF与BMF数据间可靠性较高的转化关系,实现实验室BMF数据直接用于化学品的分类管理；

(2)开发科学性及操作性较好的代谢评价方法,为生物蓄积测试的豁免、简化、优化或结果解释提供科学依据；

(3)建立稳定性、重复性及通用性较好的生物蓄积性体外替代评价体系,为无法通过OECD新305方法获取数据的物质的生物蓄积性评价提供较为可靠的数据支持。

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Study on Optimized Strategy of Fish Bioaccumulation Test Based on the OECD Guideline

Yang Jing,Liu Min,Zhao Huaqing,Deng Yunyun,Wang Lvping,Zhang Jingji,Yin Haowen*
Shanghai Academy of Public Measurement,Shanghai 201203,China

11 January 2016 accepted 5 April 2015

As one of the main parameters of environmental behavior in risk assessment,bioaccumulation is important to the classification,labeling,assessment and environmental risk control of chemicals,and it is also a criteria for identifying persistence and hazard of chemicals.A new OECD test guideline of bioaccumulation in fish,which was adopted in 2012,has brought new challenges to optimized strategy of bioaccumulation test.In this situation,a new test strategy should be developed and refined.An optimized strategy of bioaccumulation based on the new test guideline was studied based on analytic hierarchy process and literature research.Different from the traditional one, the suggested strategy focuses more on the testing levels,and provides a scientific basis for the optimization and simplification of bioaccumulation test as well as chemical safety management.

fish;bioaccumulation;optimized strategy

2016-01-11 录用日期:2015-04-05

1673-5897(2016)1-117-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20160111003

杨婧,刘敏,赵华清,等.OECD鱼类生物蓄积测试的优化策略研究[J].生态毒理学报,2016,11(1):117-125

Yang J,Liu M,Zhao H Q,et al.Study on optimized strategy of fish bioaccumulation test based on the OECD guideline[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):117-125(in Chinese)

环保公益性行业科研专项(2013167028):化学品富集环境行为参数测试技术研究

杨婧(1982-),女,工程师,研究方向为生态毒理学,E-mail:yangj@apm.sh.cn；

),E-mail:yinhw@apm.sh.cn

简介:殷浩文(1959—)，男，教授级高级工程师，主要研究方向为化学品生态风险评价及生态毒理学，发表学术论文40余篇，专著及合著6部。