喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞趋化因子配体20表达的影响

张梁宇，郭满盈，王　翔，陆亚琪，朱晓杨，郝阳阳，陈　杨

喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞趋化因子配体20表达的影响

张梁宇，郭满盈，王翔，陆亚琪，朱晓杨，郝阳阳，陈杨

张梁宇

目的观察喜树碱（CPT）对低氧（2%O2）培养下人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）趋化因子配体（CCL20）表达的影响，探讨CPT治疗斑块状银屑病可能的作用机制。方法将HaCaT细胞分为常氧组（21%O2点）和低氧（2%O2点）组，培养12 h，实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测CCL20 mRNA的相对表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）Kit测定细胞培养上清中CCL20表达；将12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L的CPT作用低氧诱导12 h的HaCaT细胞，ELISA Kit测定细胞培养上清中CCL20表达。结果常氧组和低氧组培养12 h，HaCaT细胞CCL20 mRNA表达(ΔCT值)分别为-15.19±0.13和-13.70±0.10，两组间表达差异有统计学意义（t=-14.430，P=0.001）；低氧培养12 h后HaCaT细胞（1×105个细胞）较常氧组CCL20蛋白表达增多，分别为（112.18±28.66）pg/ml、（64.36±47.85）pg/ ml，但两组间表达差异无统计学意义（t=-1.485，P=0.212）；100.0、200.0 nmol/L CPT处理低氧诱导12 h的HaCaT细胞（1×105个细胞）CCL20的表达分别为（64.35±19.70）pg/ml、（74.35 ±23.85）pg/ml，溶媒对照组为（112.18±28.66）pg/ml，组间多重比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论低氧可诱导HaCaT细胞CCL20mRNA表达增加；100.0、200.0 nmol/LCPT可抑制HaCaT细胞CCL20蛋白的表达。

银屑病；喜树碱；趋化因子配体20 ；细胞低氧；HaCaT细胞

寻常性斑块状银屑病角质形成细胞（KC）过度增生、炎症因子聚集、耗氧量增加，造成皮损局部微环境缺氧，可诱发多种前炎症因子的释放，如白细胞介素（IL）-8、低氧诱导因子（HIF）-1α等，进一步加重皮损炎症反应[1]。文献报道低氧诱导下人外周血单核细胞趋化因子配体（CCL20）mRAN表达升高[2]，推测银屑病皮损局部低氧状态可能对角质形成细胞CCL20的表达产生影响；在幼年特发性关节炎中，其滑膜液单核细胞HIF-1α蛋白的表达与CCL20 mRAN表达呈明显正相关[3]；笔者前期研究发现，喜树碱（CPT）可在一定浓度抑制低氧诱导人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞） HIF-1α蛋白的表达[4]。本实验进一步观察低氧及CPT对HaCaT细胞CCL20表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料及主要试剂

CPT相对分子质量348.36，含量＞95%（日本东京化成工业公司），4 ℃保存。HaCaT细胞系来源于第二军医大学长海医院中心实验室。二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma-Aldrich公司），胰酶（以色列bioind公司）、DMEM培养基（美国Coring公司），胎牛血清（德国PAN-Biotech GmbH公司）。 CCL20 ELISA kit（武汉BOSTER生物有限公司）。聚合酶链反应（PCR）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养及低氧处理HaCaT细胞用含10% FBS的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2的孵育箱中培养，取对数生长期的细胞用于各项实验。以2%O2、5%CO2和93%N2对HaCaT细胞进行低氧诱导。

1.2.2药物处理及分组CPT以DMSO溶解后-20℃避光保存，CPT储备浓度5 mg/ml。使用时用DMEM培养液稀释成工作浓度，DMSO的终浓度＜0.1%。将HaCaT细胞分为实验组和溶媒组，实验组加CPT+含10%FBS的DMEM培养液，即CPT的终浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L；溶媒组（对照组）为含DMSO的DMEM培养液。

1.2.3实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测CCL20 mRNA的表达实验分为常氧组和低氧组，处理时间均为12 h，收集各组细胞，采用Trizol一步法。常规方法提取RNA，按RT-PCR反转录试剂盒说明书要求进行反转录，并建立PCR反应体系。各组均取1 μl cDNA作为PCR反应模板，加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μl及上、下游引物（浓度5 μmol/L）各1 μl，最后加无DNsae-RNsae水至总体积20 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 15 s，共40个循环，于每个循环延伸段采集荧光信号。以β-肌动蛋白为内参照基因，计算目的基因的相对定量△Ct值，及依此进行统计学分析。引物序列：CCL20上游引物5'-TGCTCTTCCTTGCTTTGGCATGGGTA-3'，下游引物5'-TCTGTGCAGTGATGTGCAGGTGAAGC-3'。β-肌动蛋白上游引物5'-AGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3'，下游引物5'-ACCATCACGCCCTGGTGCCT-3'。

1.2.4ELISA kit 检测CCL20蛋白的表达实验组HaCaT细胞加入含有不同浓度的CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L），以溶媒组为对照，低氧诱导12 h，收集各组细胞培养上清液，按照ELISA kit说明书配制不同浓度标准品，根据预实验将上清以1∶2稀释，严格按照操作程序，以零孔为对照，以标准品的吸光值得出计算公式，将上清测定的吸光值代入公式的计算结果×2，即上清中每毫升CCL20含量。

1.3统计学方法

用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料以x¯ ±s表示，用Levene检验方差齐性，采用两独立样本t 检验，两因素方差分析，组间多重比较SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1常氧和低氧下HaCaT细胞CCL20mRNA和CCL20蛋白的表达（表1）

常氧组和低氧组培养12 h后，HaCaT细胞CCL20 mRNA表达（ΔCt值）分别为：-15.19±0.13、-13.70 ±0.10，两组间表达差异有统计学意义（Levene检验：F=1.022，P=0.387；t =-14.430，P=0.001）。

低氧组培养12 h后HaCaT细胞较常氧组CCL20蛋白的表达量有增多趋势，分别为：（112.18±28.66）[pg/ (ml·1×105个细胞)]、（64.36±47.85）[pg/(ml·1×105个细胞)]，但两组间表达差异无明显统计学意义（Levene检验：F=1.457，P=0.294；t =1.485，P=0.212）。

表1　不同氧压处理 HaCaT细胞12 h的CCL20mRNA和CCL20蛋白表达（x¯ ±s）

2.2CPT对低氧诱导HaCaT细胞CCL20蛋白表达的影响

不同浓度CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L）作用于低氧诱导的 HaCaT细胞12 h，细胞培养液上清CCL20表达（1×105个细胞）分别为：（140.35±26.33）pg/ml、（161.27±34.41）pg/ml、（161.27±34.41)pg/ml、（64.35±19.70）pg/ml、（74.35 ±23.85）pg/ml；其中100.0、200.0 nmol/L药物浓度组与其余各药物组及溶媒组(112.18±28.65) pg/ml比较CCL20表达下降，组间多重比较其差异有统计学意义（Levene检验：F=2.319，P=0.108； F=4.718，P=0.013；P＜0.05）（表2、图1）。

表2　不同浓度CPT对低氧诱导12 h HaCaT细胞CCL20表达的影响　（x¯ ±s）

图1　不同浓度CPT处理低氧诱导12 h HaCaT细胞培养液上清中CCL20的表达

3　讨论

趋化因子是一类可诱导的、相对分子质量为7 000～10 000的促炎细胞因子，可通过与相应受体结合对淋巴细胞、中性粒细胞等产生趋化作用，在免疫炎症性疾病中发挥重要作用。CCL20又称CC亚族趋化因子配体20，正常皮肤中CCL20表达水平非常低，银屑病皮损表皮基底层却高表达；与特应性皮炎比较，CCL20 mRNA在皮损中的表达明显增多；多种炎症因子如干扰素（INF）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-17可诱导角质形成细胞（KC）高表达CCL20，趋化CCR6阳性表达的Th17、γδT、树突状细胞向皮损聚集，提示KC分泌趋化因子CCL20在银屑病发病中有着重要的作用[5,6]。KC受到多种危险信号的刺激可以产生抗菌肽、防御素等免疫分子，启动免疫应答；受到损伤的KC会产生高水平的趋化因子CCL20[7]。慢性斑块状银屑病皮损中的低氧微环境亦可能对KC细胞产生作用。因此笔者观察低氧刺激对HaCaT细胞CCL20表达的影响，对探讨斑块状银屑病皮损的免疫病理学机制有一定的意义。

本实验低氧诱导12 h，HaCaT细胞CCL20 mRNA表达较常氧条件下明显升高；CCL20蛋白的表达量有增多趋势； 提示低氧刺激可在转录水平明显增加HaCaT细胞CCL20的表达，并对细胞分泌CCL20蛋白产生影响。推测在慢性斑块状银屑病中，KC过度增生造成局部低氧环境可促使CCL20的表达，加重银屑病的免疫反应。

0.03%CPT软膏作为外用中成药治疗慢性斑块状银屑病，疗效和0.02%丙酸氯倍他索霜类似[8]，其机制尚未完全明确。笔者前期研究表明，100.0、200.0 nmol/L CPT可显著抑制低氧诱导12 h HaCaT细胞HIF-1α蛋白的表达[4]。Bosco 等[3]在幼年特发性关节炎的滑膜液单核细胞中发现HIF-1α蛋白高表达；并将滑膜液单核细胞以1%O2和20%O2进行低氧和常氧交替处理，时间均为16 h，CCL20 mRAN和HIF-1α蛋白表达变化趋势同步。本实验中发现，不同浓度CPT（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L）作用于低氧诱导的 HaCaT细胞12 h，在HIF-1α蛋白未明显抑制的浓度组（12.5、25.0、50.0 nmol/L），CCL20蛋白分泌渐增加，在HIF-1α蛋白表达受到抑制的药物浓度组（100.0、200.0 nmol/L），CCL20表达明显下降，100.0、200.0 nmol/L浓度组间CCL20蛋白表达差异无统计学意义；提示HIF-1α蛋白与CCL20 mRNA/蛋白的表达调控可能存在相关性，一定浓度CPT可抑制HaCaT细胞CCL20的分泌。喜树碱可能对KC产生类似作用。然而，喜树碱对人KC是否产生类似作用需进一步研究。

[1] Armstrong AW, Voyles SV, Armstrong EJ, et al. Angiogenesis and oxidative stress: common mechanisms linking psoriasis with atherosclerosis [J]. J Dermatol Sci, 2011, 63(1):1-9.

[2]Bosco MC, Puppo M, Santangelo C, et al. Hypoxia modifies the transcriptome of primary human monocytes: modulation of novel immune-related genes and identification of CC-chemokine ligand 20 as a new hypoxia-inducible gene [J]. J Immunol, 2006, 177(3):1941-1955.

[3]Bosco MC, Delfino S, Ferlito F, et al. Hypoxic synovial environment and expression of macrophage inflammatory protein 3gamma/ CCL20 in juvenile idiopathic arthritis [J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(6):1833-1838.

[4] 张梁宇, 王翔, 陆亚琪, 等. 喜树碱对HaCaT细胞低氧诱导因子1α表达的影响 [J]. 中华皮肤科杂志, 2015, 48(6):400-403.

[5] Albanesi C, De Pità O, Girolomoni G. Resident skin cells in psoriasis: a special look at the pathogenetic functions of keratinocytes [J]. Clin Dermatol, 2007, 25(6):581-588.

[6] Mabuchi T, Chang TW, Quinter S, et al. Chemokine receptors in the pathogenesis and therapy of psoriasis [J]. J Dermatol Sci, 2012, 65(1):4-11.

[7] 王刚. 银屑病免疫学研究新进展 [J]. 中华皮肤科杂志, 2015, 48(4):223-225.

[8] 中国医师协会皮肤科医师分会中西医皮肤科亚专业委员会. 中成药治疗寻常性银屑病专家共识(2014) [J]. 中华皮肤科杂志, 2014, 47(3): 215-216.

（本文编辑耿建丽）

Effects of camptothecin on the expression of CCL20 in HaCaT cells under hypoxia

ZHANG Liang-yu，GUO Man-ying，WANG Xiang，et al
Department of Dermatology, 98th Hospital of PLA, Huzhou 313000, China

ObjectiveTo investigate the influence of camptothecin (CPT) on the expressions of CCL20 in HaCaT cells under hypoxia, so as to investigate the possible mechanism of CPT in the treatment of plaque psoriasis. MethodsHaCaT cells were cultured respectively in normoxia and hypoxia condition for 12 hours, the CCL20 mRNA expressions were detected by real-time PCR, the secretions of CCL20 protein were detected by ELISA kit. HaCaT cells were divided into five groups and treated with different nanomolar (12.5, 25, 50, 100, 200 nmol/L) of CPT, the five groups were cultured in hypoxia condition for 12 hours, the secretions of CCL20 protein were detected by ELISA kit. ResultsThere were significantly difference in the expression levels of CCL20 mRNA (given in ΔCT value) between the normoxia group and the hypoxia group (-15.19±0.13 vs -13.70±0.10 t=−14.430, P=0.001). The CCL20 protein secretion of HaCaT cells (1×105cells) were increased which cultured in hypoxia for 12 hours, however, there were no significantly difference in the CCL20 protein secretion of HaCaT cells (1×105cells) between the normoxia group and the hypoxia group [(112.18±28.66) pg/ml, (64.36±47.85)pg/ml, t=−1.485, P=0.212]. Hypoxia inducible for 12 hours, CPT of 100, 200 nmol/L significantly decreased the secretion of CCL20 protein (1×105cells) compared with the vehicle control group [(64.35±19.70) pg/ml, (74.35±23.85) pg/ml vs(112.18±28.66)pg/ml, P＜0.05]. ConclusionThe CCL20 mRNA expression of HaCaT cell is up-regulated in hypoxia, CPT of 100, 200 nmol/L can reduce the secretion of CCL20 protein.

Psoriasis；Camptothecin；CCL20；Cell hypoxia；HaCaT cells [J Pract Dermatol, 2016, 9(2):95-97]

R758.63

A

1674-1293(2016)02-0095-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160204

南京军区医学科技创新重点项目（12Z03）；全军医学科技青年培育项目（13QNP045）

313000 湖州，解放军第九八医院皮肤科（张梁宇，王翔，陆亚琪，朱晓杨，郝阳阳，陈杨）；解放军第九八医院检验科（郭满盈）

张梁宇，主治医师，E-mail: zlyu98@163.com

陈杨，E-mail: 98cy@163.com

（2015-10-25

2015-12-30）