卤米松对角质形成细胞维生素D受体表达的影响

刘　莲，张　斌，何　威，王儒鹏，周春丽，王　为，王玉娟，黄　珂

• 论著 •

卤米松对角质形成细胞维生素D受体表达的影响

刘莲，张斌，何威，王儒鹏，周春丽，王为，王玉娟，黄珂

刘　莲

目的观察卤米松对角质形成细胞维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）表达的影响，以探讨糖皮质激素对维生素D3衍生物治疗银屑病效应的潜在影响。方法采用CCK8法观察不同浓度卤米松、卡泊三醇在不同时相点下对HaCaT角质形成细胞增殖的影响；采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）、蛋白印迹法，观察不同浓度卤米松在不同时相点作用下HaCaT细胞VDR的表达情况。结果卤米松可增强卡泊三醇对HaCaT细胞增殖的抑制作用；卤米松作用24 h、48 h后，HaCaT细胞中VDR mRNA及蛋白水平均明显升高，并呈剂量依赖性效应。结论卤米松上调VDR的表达可能有助于提高角质形成细胞对维生素D3衍生物作用的反应性，从而有可能提高维生素D3衍生物对角质形成细胞的治疗效应。

卤米松；卡泊三醇；维生素D受体；增殖；角质形成细胞

寻常性银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要临床表现的慢性复发性炎症性皮肤疾病，以表皮细胞过度增殖、异常分化为其组织病理特征[1]。外用疗法为治疗银屑病的主要手段之一，糖皮质激素（glucocorticoid，GC）和维生素D3衍生物（vitamin D3 analog）是治疗银屑病的一线外用药物之一。GC与维生素D3衍生物主要分别通过与细胞中对应的受体GRα、VDR相结合而发挥效应。大量临床观察表明，GC联合维生素D3衍生物外用治疗银屑病的疗效明显优于两药单用[2]。曾有研究发现地塞米松可上调小鼠鳞状细胞癌癌细胞中VDR的表达[3]，这提示了GC对VDR表达的潜在调节效应。鉴于GRα和VDR均属于核受体超家族成员并可能存在着一定程度的相互影响，那么当外用GC与维生素D3衍生物联合治疗银屑病时，GC是否对维生素D3衍生物的治疗效应产生影响呢？为此，本实验以HaCaT角质形成细胞为研究对象，观察不同浓度卤米松、卡泊三醇在不同时间点对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）增殖的影响及卤米松作用后VDR的表达情况，以探讨卤米松对维生素D3衍生物治疗效应的潜在影响。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞来源HaCaT细胞购于中国医学科学院上海细胞所。

1.1.2主要试剂卡泊三醇、卤米松（澳美药业惠赠），二甲基亚砜（美国Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），1640培养基、胰蛋白酶（Hyclone公司），兔抗人VDR多克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体（碧云天生物工程有限公司），辣根过氧化酶标记的山羊抗兔、辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠（北京中杉金桥公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore公司），BeyoECL Plus显色试剂（碧云天生物工程有限公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒（日本TaKaRa Bio株式会社），CCK-8试剂盒（日本同仁生化研究所）。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理用含10%胎牛血清的1640培养液于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次。根据国外相关研究[4,5]和本课题组预实验结果，将卤米松和卡泊三醇溶解于二甲基亚砜中配置成10-1mol/L的原液，使用时再用完全培养基稀释，设定卤米松和卡泊三醇的作用浓度和时间，以含不同浓度的卤米松（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/ L、10-4mol/L）、 卡 泊 三 醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）及未加药的培养液作用于HaCaT细胞24 h、48 h，分别收集细胞中的蛋白质和RNA。

1.2.2CCK-8增殖试验选用3～5代HaCaT细胞为研究对象，将HaCaT细胞配制成细胞悬液，96孔板中每孔加入3×103个细胞，设置5个复孔，培养12 h后弃培养基，加入100 μl不同浓度卡泊三醇溶液（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。参照文献[6]，选用10-5mol/L卤米松与不同浓度卡泊三醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）混合后作用于HaCaT细胞，加药24 h、48 h后，弃培养基，PBS洗2遍，每孔中加入含10% CCK-8的无血清培养基，37℃培养箱中孵育30 min，用酶标仪于450 nm处测各孔A值，重复实验3次。

1.2.3qRT-PCR

1.2.3.1引物设计按照实时荧光定量PCR原则设计引物，检索NCBI数据库、Nucleotide数据库设计内参引物三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），GAPDH引物：上游CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，下游CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG，扩增片段119 bp，VDR引物：上游CAGAGTGTGGGAAGGGAGAG，下游TTGGGTGGTGGAGTGAGAAT，扩增片段111 bp，均已行BLAST特异性验证，引物由上海英潍捷基生物公司合成。

1.2.3.2RNA提取参照RNAiso Plus说明书进行RNA提取，采用双光束微量核酸蛋白测定仪于A260/ A280比值判定RNA纯度，并取4 μl RNA进行琼脂糖凝胶电泳，验证RNA的完整性。

1.2.3.3cDNA合成参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书配制相关试剂，42℃2 min去除基因组DNA，37℃ 15 min、85℃ 5 s反转录合成cDNA，向体系中加入180 μl无菌水稀释10倍，-20℃保存。

1.2.3.4qRT-PCR反应和结果分析参照SYBR®Premix Ex TaqTMII说明书，选择20 μl反应体系，设置5个复孔，重复实验3次，两步法扩增，预变性1个循环95℃ 30 s，PCR反应40个循环95℃ 15 s、60℃ 34 s，融解曲线1个循环95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。采用2-△△CT法对qRT-PCR结果进行数据分析。

1.2.4Western blot检测冰PBS洗不同组别的HaCaT细胞1次，加入预冷的含PMSF的全细胞裂解液于冰上裂解20 min，4℃离心（12 000 r/ min）5 min后保留上清，BCA法测定蛋白浓度后加入上清1/4量的蛋白上样缓冲液，沸水煮8 min，以5%上层胶、10%下层胶的SDS-聚丙烯胺凝胶电泳（恒压100 V，70 min），电泳结束后将蛋白印迹到PVDF膜上（100 mA，60 min），6%的脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜4次×5 min，将PVDF膜和一抗（VDR和GAPDH一抗工作浓度1∶1000）加入抗体孵育盒中4℃孵育过夜，TBST洗膜4次×5 min，二抗（辣根过氧化酶标记的山羊抗兔、辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠二抗工作浓度1∶1000）37℃孵育1 h，TBST洗膜4次×5 min，ECL化学发光法显色，重复实验3次。

1.2.5统计学方法采用统计软件SPSS17进行分析,单组采用单因素方差分析，组内两两比较用LSD法，两组效应采用析因设计方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1卤米松对卡泊三醇抑制HaCaT角质形成细胞增殖的影响

CCK8法检测HaCaT角质形成细胞的增殖，增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。与对照组比较，不同浓度卡泊三醇作用于HaCaT细胞24 h、48 h后，显著抑制角质形成细胞的增殖（P＜0.05），呈浓度依赖性趋势（图1a）。在10-5mol/L卤米松作用下，不同浓度卡泊三醇作用于HaCaT细胞24 h、48 h后，卡泊三醇对角质形成细胞增殖的浓度依赖性抑制效应仍有增强（图1b）。统计学分析后发现卤米松与卡泊三醇两药联用对角质形成细胞的抗增殖作用较单用卡泊三醇的抗增殖作用更强（P＜0.05），说明两药之间有交互效应。

图1　CCK8法检测各组角质形成细胞的增殖情况

2.2卤米松对HaCaT角质形成细胞VDR mRNA表达的影响

不同浓度卤米松作用于HaCaT细胞24 h、48 h后，经qRT-PCR检测VDR的表达，采用2-△△CT法计算各组表达量，结果表明：①与对照组比较，不同浓度卤米松作用HaCaT细胞24 h后，VDR mRNA表达上调（P＜0.05），并呈剂量依赖性；②与对照组比较，卤米松作用HaCaT细胞48 h后，VDR mRNA仍上调（P＜0.05），无明显剂量依赖性（图2）。

图2　qRT-PCR检测各组VDR mRNA表达情况

2.3卤米松对HaCaT细胞中VDR蛋白表达的影响

不同浓度卤米松作用于HaCaT细胞24 h、48 h后，经Western blot检测，VDR蛋白的相对量结果表明：与对照组比较，不同浓度卤米松作用于HaCaT细胞24 h、48 h后，VDR蛋白表达均上调（P＜0.05），并呈剂量依赖性（图3）。

图3　Western blot检测各组VDR蛋白表达情况

3　讨论

寻常性银屑病是皮肤科临床常见的慢性复发性炎症性疾病。糖皮质激素和维生素D3衍生物是银屑病外用治疗中的一线药物。卤米松是一种强效的外用糖皮质激素，具有抗炎、免疫抑制、抗细胞增殖等作用。GC主要是通过与细胞质中GRα结合而发挥生物学作用，GC与GRα的复合体移位至细胞核内与糖皮质激素受体操纵元件(GRE)结合后，进而调控基因的转录和表达[7]。维生素D3衍生物主要与细胞核内的VDR结合后，与类视黄醇x受体（RXR）形成异二聚体VDR-RXR，再与靶基因上的维生素D受体操纵元件（VDRE）结合，从而调控基因的转录和表达，发挥抗细胞增殖、诱导细胞分化、免疫调节等功能，此外还可与细胞膜上的VDR结合而发挥调节钙、磷代谢的作用[8]。

卤米松与维生素D3衍生物分别通过与核激素受体GRα、VDR结合而发挥效应。Yu等[9]研究发现，采用地塞米松作用于小鼠鳞状细胞癌细胞（SCCVII/ SF）后，可上调小鼠癌细胞中VDR的表达，提示地塞米松可通过上调细胞中VDR的表达来增强1,25-二羟维生素D3的抗肿瘤细胞效应。Hidalgo等[3]发现，地塞米松可在转录水平调节SCCVII/SF细胞中VDR的表达，呈时间及剂量依赖性，且该作用与GR的表达密切相关，因此认为GR、VDR可能存在交叉对话情况，且推测GC能增强维生素D3衍生物的抗肿瘤效应。此外，Swami等[10]发现，维生素D3可下调人乳腺癌细胞（MCF-7）中的雌激素受体的表达。上述研究结果提示了不同核激素受体之间的相互影响，也对本课题组观察卤米松对角质形成细胞VDR表达的影响的相关研究的展开具有启示作用。

笔者的研究发现，经10-5mol/L卤米松作用后，卡泊三醇对HaCaT角质形成细胞的抗增殖作用明显增强。经统计学分析后发现，卤米松与卡泊三醇具有交互效应。由此引发我们对这一现象发生的内在原因的兴趣，促使我们进一步探讨卤米松对角质形成细胞VDR表达的影响。本研究发现卤米松在不同时相点作用后，HaCaT细胞VDR无论是在mRNA或者是蛋白水平均有上调的现象，并呈浓度依赖性效应。这提示GRα、VDR两类核激素受体之间可能存在交叉对话途径，这与Hidalgo等、Yu等的发现具有相似性。卤米松对角质形成细胞VDR表达的上调效应，不但可部分解释卤米松增强卡泊三醇抑制HaCaT细胞增殖效应的现象，还可能部分解释临床实践中所观察到的糖皮质激素与维生素D3衍生物外用治疗银屑病的疗效优于药物单用的现象，这为临床上外用卤米松与维生素D3衍生物联合治疗银屑病提供了一定的实验研究依据。目前就GRα、VDR核激素受体之间如何进行交叉对话的确切机制尚不清楚，仍有待进一步研究。

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（本文编辑敖俊红）

Effects of halometasone on expression of vitamin D receptor in human HaCaT keratinocytes

LIU Lian，ZHANG Bin，HE Wei，et al
Department of Dermatology, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

ObjectiveTo investigate the effects of halometasone on the expression of vitamin D receptor(VDR) in human keratinocytes so as to evaluate the potential effects of halometasone on the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in psoriasis. Methods HaCaT cells were treated by halometasone and calcipotriol with different concentrations for various durations. The cell proliferation was observed by CCK8 assay. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression level of VDR mRNA and protein. Results Halometasone significantly enhanced the inhibitory effects of calcipotriol on keratinocyte proliferation. Halometasone upregulated the expression of VDR at the level of mRNA and protein in a concentration-dependent manner. ConclusionThe upregulation of VDR expression by halometasone in keratinocytes may partly explain the phenomenon that halometasone could enhance the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in the treatment of psoriasis.

Halometasone；Calcipotriol；Vitamin D receptor；Proliferation；Keratinocyte [JPractDermatol, 2016, 9(2):81-83]

R986；R758.63

A

1674-1293(2016)02-0081-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160201

中华医学会皮肤性病学分会澳美制药银屑病研究基金

重庆400037，第三军医大学第二附属医院皮肤科及风湿免疫科（刘莲，张斌，何威，王儒鹏，周春丽，王为，王玉娟，黄珂）

刘莲，在读硕士研究生，住院医师，研究方向：卤米松与卡泊三醇对角质形成细胞作用的影响及机制研究，E-mail: liulian422@163.com

何威，E-mail: weiheskin@163.com

（2016-01-20

2016-03-03）