补体活化对妊娠合并系统性红斑狼疮胎儿不良结局影响的相关性研究

周玉秀，刘恩令，李君，张艳梅，王立群，韩宝风

（河北医科大学附属唐山市工人医院1.风湿免疫科，2.妇产科，河北 唐山 063000）

补体活化对妊娠合并系统性红斑狼疮胎儿不良结局影响的相关性研究

周玉秀1，刘恩令2，李君2，张艳梅2，王立群2，韩宝风1

（河北医科大学附属唐山市工人医院1.风湿免疫科，2.妇产科，河北 唐山 063000）

目的探讨补体活化对抗磷脂抗体介导妊娠合并系统性红斑狼疮（SLE）胎儿不良结局的影响。方法选取2013年12月-2015年12月该院收治的20例妊娠合并SLE患者产后胎盘作为观察组，另选同期该院20例正常妊娠分娩孕妇产后胎盘作为对照组，比较两组孕妇妊娠结局、新生儿红斑狼疮发生情况，同时对孕妇产后胎盘进行常规的病理检查，并采用免疫组织化学法染色检测孕妇体内C1q和C4d的表达。结果观察组自然流产/死胎例数高于对照组（P＜0.05）；正常分娩例数、分娩孕周、新生儿出生体重及胎盘重量均低于对照组（P＜0.05）。显微镜下对观察组SLE患者病理切片进行观察显示，组织均出现不同程度的灶性钙化、退变、炎症细胞浸润和局部梗死。观察组与对照组胎盘免疫组织化学法染色检测C1q表达比较，差异无统计学意义；观察组C4d免疫组织化学法染色阳性率和阳性积分分别为100%和（3.5±0.9）分，对照组为0%和0分，两组C4d免疫组织化学法染色阳性率和阳性积分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组20例孕妇中，非指导性妊娠组中1例新生儿确诊为新生儿红斑狼疮。指导性妊娠组未发生新生儿红斑狼疮。结论SLE合并妊娠患者，胎儿丢失率较高，容易发生不良妊娠结局。SLE产妇胎盘切片免疫组织化学法染色检测母婴交界处C4d沉积情况与胎儿不良结局密切相关，在补体活化影响APL介导的妊娠合并SLE患者妊娠过程中，C4d可作为母婴不良结局的预测生物标志物，为SLE患者选择妊娠时机，以及再次妊娠的临床治疗提供依据。

补体活化；妊娠；系统性红斑狼疮；母婴结局

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫性炎症性疾病，多发于20～40岁育龄女性，该病可累及机体多个系统和脏器脏器，并且容易造成不良妊娠结局[1]。据数据统计显示，SLE患者妊娠后容易发生死胎、胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）以及自然流产等[2]。研究表明，约30%SLE患者中的血清检测存在抗磷脂抗体，而心磷脂抗体及狼疮抗体与不良妊娠结局密切相关[3]。抗磷脂抗体（antiphospholipid antibodies，aPL）阳性的SLE患者，容易发生动脉及静脉血栓、习惯性流产、血小板减少，而抗体阳性的妊娠患者容易引发胎盘滋养层绒毛血管形成血栓，最终导致导致妊娠失败。补体为机体内的一组蛋白，经活化后具有酶活性，存在于血清及组织液中，能够介导体内免疫及炎症反应。研究表明，SLE患者妊娠后，位于胎盘的抗磷脂抗体激发经典补体激活途径激活补体，生成过敏毒素，同时产生C4d及C1q等细胞因子，介导效应细胞激活[4]。补体激活是引发系统性红斑狼疮胎儿不良结局的重要因素，故研究补体激活与系统性红斑狼疮胎儿不良结局的相关性对于改善妊娠不良结局尤为重要。目前，国内关于SLE合并妊娠患者胎盘组织免疫组织化学法染色检测C4d和C1q研究较少，且关于补体活化对抗磷脂抗体介导的妊娠的影响机制尚未明确。因此本研究选择妊娠合并SLE患者产后胎盘作为研究对象，通过对胎盘进行病理切片分析，同时检测相关细胞因子表达，旨在探讨补体活化对aPL介导妊娠合并SLE不良结局影响，为临床系统性红斑狼疮妊娠患者选择合适的妊娠时机提供合理的依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2013年12月-2015年12月本院收治的20例妊娠合并SLE患者产后胎盘作为观察组，孕妇年龄（28.3±6.7）岁，孕期4例使用肝素治疗，合并抗磷脂综合征者3例，合并急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）-免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）者3例。其中，14例为指导性妊娠，6例非指导性妊娠。选择同期来本院住院分娩的20例正常妊娠孕妇产后胎盘作为对照组，孕妇年龄（27.1±6.5）岁，孕期无使用肝素治疗者，且所有对照组孕妇经实验室常规化验、相应的自身免疫全套检查以及抗心磷脂抗体检测均确认结果正常。两组产妇年龄等基本基线比较，差异无统计学意义，具有可比性（P＞0.05）。本研究获得孕妇及其家属同意，并获得本院伦理委员会批准。

纳入标准：观察组患者经临床确诊，均符合2010年中华医学会风湿病学分会《系统性红斑狼疮诊断及治疗指南》中关于系统性红斑狼疮的诊断标准[5]。患者知情且同意本研究方案。排除标准：①排除合并自身免疫性疾病、妊娠期高血压疾病患者；②排除合并肝肾、心脑血管系统疾病患者；③排除不签署知情同意书患者。

1.2实验方法

观察组患者依据患者妊娠情况，分为指导性妊娠患者和非指导性妊娠患者。其中指导性妊娠14例，非指导性妊娠6例，分组标准如下：①指导性妊娠组：患者合并SLE病情为控制期或进入缓解期半年以上，经相应对症治疗措施后病情已经得到明显缓轻，同时已停用细胞毒性药物和激素类药物或仅维持小剂量强的松（10 mg/d）治疗≥1年。针对狼疮性肾炎患者，患者需经前期治疗达到预期的治疗目标，及24 h尿蛋白定量＜3 g/24 h，临床检查显示，患者肾功能相关指标正常，血压处于正常水平。②非指导性妊娠组：孕妇孕前1年内表现系统性红斑狼疮病情活动。

观察组患者中指导性妊娠患者给予以下治疗：所有产妇于怀孕期间行定期检查，检查次数为10～15次。针对怀孕期已经停用激素类药物的红斑狼疮患者，应于妊娠后给予强的松5～15 mg/d，而针对孕前已经开始服用强的松5～15 mg/d的妊娠患者药物剂量应于妊娠后加倍。本组患者中2例患者怀孕期间SLE病情活动，临床强的松用药剂量增大，最大剂量控制在20 mg/d。患者正常分娩后强的松剂量加倍，静脉滴注氢化可的松（100 mg/d）或甲强龙（40 mg/d），连续治疗3 d后根据患者病情缓解考虑酌情减量。

观察组中非指导性妊娠患者治疗方案如下：非指导性妊娠6例，4例产妇于怀孕期间行定期检查，检查次数为8～13次，2例未定期产检，产检次数1～6次。于怀孕前已临床确诊为系统性红斑狼疮的患者，孕前给予强的松20 mg/d，怀孕期间出现，最大剂量控制为60 mg/d。患者正常分娩后，强的松剂量加倍，静脉滴注氢化可的松（100 mg/d）或甲强龙（40 mg/d），连续治疗3 d。针对入院后血凝指标检查提示存在高血凝风险的患者，应于分娩前及产后1d后皮下注射低分子肝素行抗凝治疗。

1.3观察指标

①记录两组孕妇妊娠结局，包括自然流产/死胎例数、新生儿窒息例数、正常分娩例数、分娩孕周、新生儿出生体重和胎盘重量；②记录观察组新生儿红斑狼疮发生情况；③所有产妇分娩后，采集胎盘，将胎盘组织切片，用于免疫组织化学法检测。

对两组患者所有胎盘组织切片进行Elivision二步法免疫组织化学法染色、苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，检测C1q和C4d的表达。小鼠抗人补体C1q抗体（上海麦柏星生物科技有限公司），兔抗人C4d多克隆抗体（北京达科为生物技术有限公司），二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。所有检测试验均严格按照试剂盒的说明书进行操作。阴性对照为磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）C1q、C4d。

所有石蜡切片免疫组织化学法及HE染色后，由本院两位经验丰富的病理医师采用光学显微镜观察胎盘切片病理变化和C1q和C4d阳性率，计算阳性积分。阳性评分标准：观察检测绒毛内皮细胞基底膜或合体滋养层免疫复合物沉积情况和显微镜下染色分布情况，经观察检测沉积物在绒毛内皮细胞基底膜或合体滋养层呈线状分布，显色为红色。同时对观察组和对照组产妇胎盘免疫复合物进行半定量评估[2]，依据免疫复合物沉积范围进行评价：＞50%为2分，＜50%为1分，阴性为0分。依据显微镜下免疫复合物染色强度进行分布：低倍镜下观察为强阳性记为强显色，评分为3分；低倍镜下观察为阳性记为中度显色，评分为2分；低倍镜下观察疑为阳性转为高倍镜下观察确认为阳性则记为弱显色，评分为1分。阳性积分=显色积分×沉积范围积分。

1.4统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以百分比或率表示，用χ2检验，对于胎儿妊娠结局的比较，当理论频数（T）1～5时用校正的χ2检验，当理论频数（T）＜1时用Fisher确切概率法；两组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组孕妇妊娠结局比较

观察组自然流产/死胎发生率为25.0%（5/20），对照组自然流产/死胎发生率为0.0%（0/20），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.711，P=0.017），观察组自然流产/死胎发生率高于对照组，对照组孕妇分娩孕周、新生儿出生体重、正常分娩例数及胎盘重量均高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1　两组患者妊娠结局比较（n=20）

2.2胎盘石蜡切片病理检查

对照组20例产妇经胎盘石蜡切片病理检查显示，绒毛组织均出现不同程度的灶性钙化和退变，但并未发现炎症细胞浸润和绒毛梗死。而观察组显微镜观察结果显示，胎盘组织存在不同程度的灶性钙化和退变，且可见不同程度的炎症细胞浸润和局部梗死。见图1。

图1　两组患者病理切片（HE×100）

2.3两组孕妇胎盘免疫组织化学法染色C4d检测结果比较

观察组20例孕妇胎盘C4d免疫组织化学法染色均呈阳性，其中12例C4d呈弥漫性染色。其中非指导性妊娠9例，阳性积分为（4.6±0.7）分，指导性妊娠3例，阳性积分为（3.5±0.5）分，经t检验，差异有统计学意义（t=2.482，P=0.032），非指导性妊娠孕妇胎盘C4d阳性积分高于指导性妊娠组。8例C4d呈局灶性染色，其中非指导性妊娠5例，阳性积分为（2.6±1.1）分，指导性妊娠3例，阳性积分为（2.9± 1.5）分，非指导性与指导性妊娠孕妇胎盘C4d阳性积分比较，经t检验，差异无统计学意义（t=0.329，P= 0.753）。弥漫性染色患者出现7例胎儿生长受限（58.3%），8例早产（66.7%），局灶性染色患者1例早产（12.5%），经t检验，差异有统计学意义（χ2=7.181和5.692，P=0.007和0.171），弥漫性染色患者胎儿宫内窘迫率、早产率高于局灶性染色患者。见图2。

图2　孕妇胎盘C4d免疫组织化学法染色（×100）

观察组C4d免疫组织化学法染色阳性率和阳性积分分别为100%和（3.5±0.9）分，对照组为0%和0分，经t检验，差异有统计学意义（t=16.801，P= 0.000），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=40.000和0.000），观察组C4d免疫组织化学法染色阳性率和阳性积分高于对照组。见表2。

2.4两组孕妇胎盘免疫组织化学法染色C1q检测结果比较

两组孕妇妊娠胎盘C1q免疫组织化学法染色均呈阳性。观察组中11例C1q呈弥漫性染色，其中非指导性妊娠8例，阳性积分为（3.1±0.7）分，指导性妊娠3例，阳性积分为（3.0±0.8）分，指导性与非指导性组C4d阳性积分比较，经t检验，差异无统计学意义（t=0.001，P=1.000）。9例C4d呈局灶性染色，其中非指导性妊娠6例，阳性积分为（2.5±1.0）分，指导性妊娠3例，阳性积分为（2.4±1.2）分，指导性与非指导性组C4d阳性积分比较，经t检验，差异无统计学意义（t=0.133，P=0.898）。对照组3例呈弥漫性染色，17例呈局灶是染色。见图3。

观察组C1q免疫组织化学法染色阳性率和阳性积分分别为100%和（2.7±0.8）分，对照组为100%和（2.8±0.9）分，两组C1q免疫组织化学法染色阳性率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.633，P=0.272）；两组阳性积分比较，经t检验，差异无统计学意义（t=0.722，P=0.153）。见表3。

2.5观察组新生儿红斑狼疮发生率分析

观察组20例孕妇中，非指导性妊娠组中1例新生儿确诊为新生儿红斑狼疮（下肢呈片状红色皮损）。指导性妊娠组未发生新生儿红斑狼疮。见图4。

图3　孕妇胎盘C1q免疫组织化学法染色（×100）

表2　孕妇胎盘免疫组织化学法染色C4d检测结果比较（n=20）

表3　孕妇胎盘免疫组织化学法染色C1q检测结果比较（n=20）

图4　新生儿红斑狼疮

3 讨论

SLE患者妊娠后容易发生FGR、自然流产、死胎等妊娠不良结局，而上述妊娠不良结局的发生与胎盘病理因素有关。抗磷脂抗体定位于胎盘，通过经典补体激活途径激活补体，激活效应细胞，生成过敏霉素，引起胎盘出现病理状态，从而导致不良妊娠结局[6]。因此，研究补体活化对抗磷脂抗体介导妊娠合并系统性红斑狼疮胎儿不良结局影响的相关性，对于SLE患者妊娠指导至关重要。本研究中观察组显微镜观察结果显示，胎盘组织存在不同程度的灶性钙化和退变，且可见不同程度的炎症细胞浸润和局部梗死，提示胎盘病变与新生儿不良结局密切相关。

补体为机体内的一组蛋白，经活化后具有酶活性，存在于血清及组织液中，能够辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用、免疫复合物的清除及炎症反应。血液中的补体通常处于无活性状态，但通过相关激活因子的活化作用，相应的补体得到激活。补体激活路径大致分为经典激活途径、旁路激活途经，以及甘露糖结合凝集素途径激活。经典激活途径中主要通过CRP反应蛋白或免疫复合物与C1q相结合启动补体激活途径[7]。

C1q为补体经典激活路径激活过程中早期重要的启动因子，而补体C4为多功能β1-球蛋白。在补体传统途径活化中，C4被C1s水解为C4a、C4b，C4b可进一步裂解为C4d，具有促进补体活化和免疫细胞吞噬的作用，同时还能中和病毒并防止免疫复合物沉着。C4是补体经典激活途径的一个重要组分，对C4的临床检测有助于SLE等自身免疫性疾病诊断，为临床治疗提供合理依据。CHOEN等[8]研究发现，SLE或合并APS的妊娠患者胎盘免疫组织化学法染色检测均显示，胎盘母婴交界处存在C4d弥漫性染色，且与胎儿的不良结局密切相关。提示补体活化妇女不良妊娠结局中起重要作用，胎盘C4d和C1q检测可有效预测妊娠结局。研究表明，病理妊娠与胎盘aPL通过补体激活途径激活补体密切相关[9]。国外动物实验研究发现，含有抗磷脂抗体的人IgG能够抑制C3经典补体激活路径和旁路激活路径，从而抑制小鼠体内补体级联反应，防止SLE合并APS的妊娠小鼠aPL介导流产，降低小鼠FGR发生几率[10]。

本组研究发现，SLE20例胎盘石蜡切片中，C4d阳性率为100%，高于对照组，提示SLE组不良妊娠结局与胎盘中高C4d阳性率相关。病理分析表明，在合体滋养层或绒毛内皮细胞基底膜以局灶性或弥漫性染色模式呈现，其中弥漫性染色胎盘C4d阳性率、阳性积分及不良妊娠结局发生率高于局灶性染色者，而母婴交界处存在C4d大量沉积，分析认为是由抗体介导所致胎盘病理损伤的所致，说明补体活化是影响抗磷脂抗体介导的妊娠合并SLE不良母婴结局的重要因素，因此，临床上可以通过对胎盘C4d表达进行测定从而为有妊娠合并SLE患者再次妊娠的治疗提供依据。其中，12例C4d弥漫性染色患者中，非指导性妊娠孕妇胎盘C4d阳性积分高于指导性妊娠组，因此临床上多建议SLE患者选择妊娠时机时选择缓解期及控制期进行受孕。本研究结果显示，观察组与对照组胎盘C1q表达阳性率和阳性积分比较，差异无统计学意义。分析认为，C1q为补体经典激活早期成分，其存在一定程度上反映产妇体内IgM和IgG抗体的生理水平。但合体滋养层细胞的补体调节机制能够正常调节C1q的生理水平并不会造成晚期补体级联反应。此外，本研究所纳入研究样本较少，研究结果具有一定局限性，仍需深入研究。

综上所述，系统性红斑狼疮合并妊娠患者，胎儿丢失率较高，容易发生不良妊娠结局。SLE产妇胎盘切片免疫组织化学法染色检测母婴交界处C4d沉积情况与胎儿不良结局密切相关，因此，在补体活化影响APL介导的妊娠合并SLE患者妊娠过程中，C4d可作为母婴不良结局的预测生物标志物，为SLE患者选择妊娠时机以及再次妊娠的临床治疗提供依据。

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（童颖丹 编辑）

Relationship between complement activation and maternal-fetus outcome of pregnancy complicated with systemic lupus erythematosus

Yu-xiu Zhou1,En-ling Liu2,Jun Li2,Yan-mei Zhang2,Li-qun Wang2,Bao-feng Han1
(1.Department of Rheumatic Immunology;2.Department of Obstetrics and Gynecology, Tangshan Gongren Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To explore the relationship between complement activation and antiphospholipid (APL)antibody associated maternal-fetus outcome of pregnancy complicated with systemic lupus erythematosus (SLE).Methods Twenty cases of pregnant women complicated with SLE from December 2013 to December 2015 in our hospital were selected as research objects in the study group.At the same time,20 cases of normal pregnant women were selected as the control group.The maternal-fetus outcome and incidence of neonatal lupus erythematosus were compared.Meanwhile,the C1q and C4d of the pregnant women were examined by placenta pathology and immunohistochemistry and compared between the two groups.Results Compared with the control group,the spontaneous abortion(stillborn foetus)rate in the study group was statistically higher(P＜0.05);however,the gestational week was shorter,the normal delivery rate and the weight ofneonates and placentas in the study group were significantly lower(P＜0.05).Pathological examination revealed 20 placentas of pregnant women in the study group were partly calcificed with degeneration of villi, thrombopoiesis,inflammatory cell infiltration and local infartion.There was no difference in the expression of the C1q between the two groups.The C4d immunohistochemical staining positive rate and the positive points in the study group were statistically higher than those in the control group(P＜0.05).Neonatal lupus erythematosus was found in 1 case of the non-guidance-pregnancy group.Conclusions The pregnant women with SLE are prone to poor neonatal outcome with high pregnancy loss rate.C4d deposition in maternal-fetal junction of SLE pregnancies has close association with adverse fetal outcome.As a result,C4d could be selected as a biomarker for APL associated maternal-fetus consequence,which provides an evidence for timing of pregnancy and having a successful secondary pregnancy.

complement activation;pregnancy;systemic lupus erythematosus;maternal-fetus outcome

R714.2

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.015

1005-8982（2016）21-0073-06

2016-04-18

刘恩令，E-mail：enling111@sina.com；Tel：13832828669