子宫颈癌与纤维蛋白原基因多态性的相关性研究

丛硕，曾小菁，洪科锋，邱爱佳

（1.贵州省肿瘤医院输血科，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院输血科，贵州 贵阳 550001）

子宫颈癌与纤维蛋白原基因多态性的相关性研究

丛硕1，曾小菁2，洪科锋1，邱爱佳1

（1.贵州省肿瘤医院输血科，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院输血科，贵州 贵阳 550001）

目的探究在子宫颈癌发病过程中与纤维蛋白原（Fg）β448G/A基因多态性的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性分析的方法对2013年5月-2014年12月初次就诊的汉族子宫颈癌患者141例标本与同期收集的健康汉族女性体检者141例标本的Fgβ448G/A基因多态性进行基因型分型检测，并对检测结果进行统计分析。结果①病例组Fgβ448G/A基因型频率及等位基因频率与对照组比较，病例组高于对照组（P＜0.05）；②A等位基因与子宫颈癌的发生密切相关，③子宫颈癌GG、GA及AA基因型的血浆Fg水平分别是（3.09±0.22）、（3.11±0.26）和（3.31±0.51）g/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论Fgβ448G/A基因多态性变化与宫颈癌的发生可能具有相关性。

子宫颈癌；基因多态性；纤维蛋白原

子宫颈癌作为妇科疾病中最为常见的三大恶性病变之一，在其癌变的过程中，除人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染及持续存在外，还有其他因素参与子宫颈上皮的病理组织学改变并导致恶性肿瘤的发生[1]。纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）能够在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，从而参与到机体的凝血机制中。当血浆的Fg浓度明显升高时，会对血管内皮细胞具有损伤作用。Fg作为凝血因子和非特异的炎症因子，已成为许多疾病已知的重要危险因素之一[2-5]。大量研究表明，当血浆Fg浓度增高时，血管疾病的发病率也会相对增高，Fg更是动脉硬化和血栓形成的独立危险因素[5-7]，严芝强等[8]的最新研究结果表明，Fg基因多态性与胃癌等恶性肿瘤的发生、发展及其分期具有一定的相关性，但Fgβ448G/A的基因多态性与子宫颈癌发生、发展的相关性研究尚未见报道，因此本实验希望通过研究病例组与对照组的基因和基因型分布情况，探究Fg基因多态性与子宫颈癌发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1病例资料

选取2013年5月-2014年12月于贵州省肿瘤医院病理检查确诊为子宫颈癌，且无转移、无系统治疗的141名汉族患者作为病例组，平均年龄（44.0±3.0）岁；同期在贵州省肿瘤医院体检的汉族女性健康体检者为对照组，平均年龄（41.8±4.5）岁。1.2实验试剂及仪器

1.2.1主要试剂聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）Mix（北京天根生化科技有限公司），引物合成为正向引物：AACATCAGATCCCCAGAAAAC AG，反向引物：GGTGAGCAAGAGAAATGAAGAA（上海生工生物工程股份有限公司），MarkerⅠ（北京天根生化科技有限公司），限制性内切酶MnIⅠ（立陶宛MBI Fermentas公司），琼脂糖（西班牙Biowest公司）。

1.2.2主要仪器PE9700扩增仪（美国ABI公司），DNA成像分析器Gel Doc EQ（美国Bio-Rad公司），DYY–Ⅲ–5型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），Millipore超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.3DNA标本收集

收集乙二胺四乙酸二钾抗凝全血，离心吸取白细胞层，置入-60℃冰箱冷冻保存。

1.4血浆Fg浓度测定

统计子宫颈癌患者于检验科初次检测的血浆Fg浓度。

1.5DNA提取

利用酚-氯仿法提取282份样本DNA，置入-60℃冰箱分装冷冻保存。

1.6PCR扩增

PCR反应体系为25μl，含模板DNA和引物各1μl，Taq酶13μl，双蒸水9μl；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性50 s，54℃退火60 s，72℃延伸70 s，共35个循环后，72℃再次延伸5 min，扩增产物降温至4℃冰箱保存备用。

1.7PCR扩增产物的检测

取5μl PCR产物，于2%琼脂糖凝胶、5×Tris-硼酸缓冲液中，以141 V电压，电泳约60 min，以分子量为100～700 bp的Marker为相对分子质量标准，在紫外成像仪下观看并分析。

1.8PCR产物酶切分型

反应体系中加入5μl PCR产物，2μl 10× buffer，0.5μl限制性核酸内切酶（Fg448G/A的内切酶为MnlⅠ），加双蒸水至25μl，37℃恒温孵育16 h，酶切产物按1.6进行电泳并在紫外成像仪下观看和分析结果。

1.9统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，用χ2检验。基因型及等位基因频率利用直接计数法进行统计分析。采用非条件Logistic回归法计算比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1子宫颈癌患者各基因型Fg水平分析

子宫颈癌患者GG、GA及AA基因型分别为76、60和5例，血浆Fg水平浓度分别为（3.09±0.22）、（3.11±0.26）和（3.312±0.505）g/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2PCR产物结果

2.2.1Fgβ448G/A基因分型PCR产物鉴定Fgβ448G/A多态性片段PCR产物经电泳后经紫外灯观察，可见PCR产物中有427 bp大小的条带。见图1。

图1　Fgβ448G/A位点PCR产物

2.2.2Fgβ448G/A基因酶切产物分型鉴定Fgβ448G/APCR扩增片段为427bp，有2个MnlⅠ酶切位点的产物片段，GG基因型酶切产生183、132和112 bp 3个片段，AA基因型缺乏其中1个MnlⅠ酶切位点，酶切后产生315和112 bp 2个片段，GA基因型酶切后产生315、183、132和112 bp 4个片段。见图2。

图2　Fgβ448G/APCR产物酶切分型鉴定

2.2.3PCR产物碱基序列测定随机在病例组GG、GA和AA3个基因型的标本中，各抽取1个标本进行目的片段扩增，得到的3份扩增产物送上海生物工程股份有限公司进行碱基序列检测。见图3。

图3　PCR扩增产物碱基序列检测

2.3Fgβ448G/A基因多态性Hardy-Weinberg平衡检验

Fgβ448G/A基因多态性进行Hardy-Weinberg平衡检验，病例组及对照组人群基因型及等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。见表1。

表1　两组Fgβ448G/A基因多态性Hardy-Weinberg平衡检验（n=141）

2.4两组Fgβ448G/A基因型及其等位基因频率分布

对病例组与对照组Fgβ448G/A基因型及其等位基因频率分布进行比较，经χ2检验，两组中各基因型及等位基因频率分布差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　两组Fgβ448G/A基因频率及基因型频率分析例（%）

2.5Fgβ448G/A基因型对子宫颈癌的相对危险性

对样本的统计结果进行非条件单变量Logistic回归分析，探讨Fgβ448G/A基因多态性与子宫颈癌发生、发展的相关性，结果表明，GA+AA型相对于纯合子GG型，能使子宫颈癌发病率显著升高。见表3。

表3　不同Fgβ448G/A基因型对子宫颈癌的相对危险性例（%）

3 讨论

Fg是由肝细胞合成、分泌的一种急性时相反应糖基化蛋白[9]，半衰期为3～4d，占血浆成分的2%～3%，约为2～4g/L[10]，是血浆中含量最高的凝血因子，其由分子量为67.6kD的α链、分子量为52.3 kD的β链及分子量为48.9 kD的γ链的3条肽链通过二硫键连接后形成二聚体[10]，使其成为肿瘤细胞和宿主细胞间的分子桥梁，与高表达Fg受体α5β1、αvβ3整合素或CD54分子等内皮细胞上的受体结合，促使肿瘤细胞和靶器官内皮细胞之间的黏附作用，加上Ⅱb和Ⅲa的复合物是血浆Fg的受体，所以机体内的肿瘤细胞能够借助血浆Fg和血小板的Ⅱb和Ⅲa复合物相互作用，形成大的复合物聚集体，从而逃脱人体免疫系统的杀灭作用。Fg作为不同黏附分子的配体，能增加血液中有型成分及肿瘤细胞间的黏附结合[7]，在肿瘤转移中起至关重要的作用。

本研究发现，基因型以Fgβ448的纯合子GG和杂合子GA为主（＞90%），而纯合子AA基因型较少（＜10%），与龚五星等[11]的研究结果相似。病例组Fgβ448G/A基因GG、GA、AA分为0.539、0.426和0.035；对照组Fgβ448G/A基因GG、GA、AA分为0.667、0.326和0.007，差异有统计学意义（χ2=6.422，P=0.040），推论出Fgβ448G/A的基因多态性和子宫颈癌的发生有一定的相关性。通过对样本的统计结果进行非条件单变量Logistic回归分析，结果显示，杂合型GA与纯合子AA虽未直接显示与子宫颈癌发生、发展有差异性，但其P值接近于0.05，杂合型GA的O＾R=1.61（95%CI：0.99，2.63），纯合子AA的O＾R= 6.18（95%CI：0.07，54.07），推测只要扩大研究的样本量，基因型GA和AA会与子宫颈癌的发生有关，且研究中表明GA+AA能使子宫颈癌发生的可能性升高（χ2=4.799，P=0.028），O＾R=1.71（95%CI：1.06，2.77），而A等位基因与G等位基因的分布则有明显的差异（χ2=5.187，P=0.023），O＾R=1.61（95%CI：1.07，2.43），可以推测Fgβ448G/A位点单个碱基的改变在子宫颈癌的发病中发挥重要作用。

而在针对患者血清Fg水平的研究中发现，子宫颈癌患者GG、GA及AA基因型分别为76、60和5例，血浆Fg水平浓度分别为（3.09±0.22）、（3.11± 0.26）和（3.312±0.505）g/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。但整体水平上，A等位基因的水平高于G等位基因，推测是因为141例子宫颈癌患者均是初次确诊且无转移，而其血浆Fg水平尚未发生明显改变。总之，Fgβ448G/A基因多态性用于易感人群的检测，对子宫颈癌的早期防治具有重要的临床意义。Fgβ448G/A基因多态性与子宫颈癌的发生可能具有相关性。

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（童颖丹 编辑）

Correlation betweenoccurrence of cervical cancer and genetic polymorphisms ofFgβ-448G/A

Shuo Cong1,Xiao-jing Zeng2,Ke-feng Hong1,Ai-jia Qiu1
(1.Department of Blood Transfusion,Guizhou Cancer Hospital,Guiyang,Guizhou 550004, China;2.Department of Blood Transfusion,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550001,China)

Objective To detect the relationship between cervical cancer and gene polymorphisms ofβfibrinogen gene(Fgβ)-448G/A.Methods Polymorphisms ofFgβ-448G/Agene were detected and analyzed in the specimens from 141 cervical cancer patients and 141 healthy controls using polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism method.Results The genotype frequency and allele frequency of Fgβ-448G/Ain the cervical cancer group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05). The allele A was closely associated with the incidence of cervical cancer.The plasma Fg levels in the cervical cancer patients with the genotypes GG,GA and AA were(3.09±0.22)g/L,(3.11±0.26)g/L and(3.31± 0.51)g/L respectively without obvious differences(P＞0.05).Conclusions The gene polymorphism ofFgβ-448G/Ais possibly associated with the incidence of cervical cancer.

cervical cancer;gene polymorphism;fibrinogen

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.006

1005-8982（2016）21-0030-05

2016-02-17

曾小菁，E-mail：zengxiaoqing@medmail.com.cn；Tel：13308506266