胚胎脊髓移植结合神经生长因子对损伤脊髓老年大鼠的修复作用

解锦鼎 安 宁 曹文慧 杨晓帆 李小苹

(牡丹江林业中心医院骨科，黑龙江 牡丹江 157000)



胚胎脊髓移植结合神经生长因子对损伤脊髓老年大鼠的修复作用

解锦鼎 安 宁1曹文慧1杨晓帆1李小苹1

(牡丹江林业中心医院骨科，黑龙江 牡丹江 157000)

目的 分析胚胎脊髓移植(FSC)结合神经生长因子修复损伤脊髓的老年大鼠模型。方法 将28只体重250～300 g的健康Wistar大鼠用于制作脊髓损伤模型，其中和双下肢瘫痪标准相符的24只分为单纯脊髓损伤组(A组)、脊髓损伤结合外源性神经生长因子组(B组)、脊髓损伤结合FSC组(C组)、脊髓损伤结合FSC兼用神经生长因子组(D组)4组，每组6只。将10 μl移植物注入B、C、D组体内。结果 B、C、D组移植手术后2、4、6、8 w的联合行为评分(CBS)、神经元面积均显著低于或高于A组(P<0.05)，D组移植手术后2、4、6、8 w的CBS、神经元面积显著低于或高于B、C组(P<0.05)。结论 FSC结合神经生长因子能够有效修复老年大鼠的损伤脊髓功能。

胚胎脊髓移植；神经生长因子；损伤脊髓

脊髓损伤引发的神经元萎缩是否能够在胚胎脊髓移植(FSC)结合神经生长因子的作用下得到挽救、大鼠脊髓损伤后的功能是否能够在其作用下得到恢复及二者的协同作用尚不清楚，本实验分析FSC结合神经生长因子修复损伤脊髓老年大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 主要仪器：自制改良Allen打击器、病理切片机OPTICKI型(Japan)、光学显微镜CX40RF200型(Olympus Optical Co.LTD Japan)、离心机LXZ-64-01型(北京医疗仪器厂)、计算机图像分析仪MIAS-2000型(四川大学图像研究所)。主要试剂：自制胚胎脊髓悬液、Nissl染色试剂(甲苯蓝试剂，北京化工制品有限公司)、神经生长因子(北京圣日医药科技发展有限公司)。Wistar孕鼠(第1天：阴栓出现2 w后剖腹将胚胎脊髓取出)、Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心)。

1.2 模型制作及分组 28只体重250～300 g的健康Wistar大鼠给予腹腔注射750 mg/kg 20%乌拉坦进行麻醉，帮助其取俯卧位，在手术板上固定，用碘伏常规备皮消毒。将无菌巾铺上，在以T7棘突为中心的背正中纵行开一长4 cm的切口，切开皮下组织对两侧椎旁肌进行剥离。将T7棘突及椎板切除，将硬膜暴露，将有直径为2 cm打击头的改良Allen打击器放置其中，对重量为10 g的打击重锤进行调节，高度为5 cm。使重锤自然下落，将打击重量保持在50 g/cm2。以较快的速度将打击头及重锤移开，对创面进行清理，将切口逐层缝合起来。单笼饲养动物，定时为其挤尿，每8 h 1次，喂养3 d，期间4只死亡。余下的24只与双下肢瘫痪标准相符，分为单纯脊髓损伤组(A组)、脊髓损伤结合外源性神经生长因子组(B组)、脊髓损伤结合FSC组(C组)、脊髓损伤结合FSC兼用神经生长因子组(D组)4组，每组6只。

1.3 移植方法 将制作脊髓损伤动物模型取出来，将损伤脊髓处硬膜暴露，途径为手术入路；将皮试注射器向损伤中心垂直刺入，抽取少量渗液，抽取过程中以较慢的速度；将移植物取出，在此过程中用皮试注射器，分别刺入头尾1.5 cm，位置为损伤中心，刺入角度为45°斜角，3 min内匀速将10 μl移植物注入B、C、D组体内；对渗出情况进行严密观察，然后逐层缝合，单笼饲养，定时为其挤尿，每8 h 1次，完成标准为其能够自行排尿。

1.4 联合行为评分(CBS) 制模术后6 h、移植术后2、4、6、8 w分别对脊髓损伤后运动、反射等后肢功能进行综合评定，评定过程中运用Cale综合评分方法，分值在0～100分，大鼠的神经功能和分值呈显著的负相关关系，即0分为具有完全正常的神经功能，100分为完全丧失神经功能〔1〕。

1.5 形态学检查 ①标本取材。将大鼠处死，将其脊髓标本切取，计所有时相点，每组3只。给予大鼠750 mg/kg 20%乌拉坦麻醉，帮助大鼠取仰卧位，在手术板上固定，开胸将其心脏暴露，进行主动脉插管，切开右心房，将生理盐水灌注其中，改用10%甲醛溶液灌注的标准为有无色液体从右心房切口溢出，停止灌注的标准为刺激性气体从右心房切口溢出2 min后，2 h后从原手术入路将T7暴露出来，计T4～T10椎体，分别切片并进行HE、甲苯胺蓝、嗜银染色，位置为所有标本头尾两侧及损伤中心；②光镜观察。HE染色切片、甲苯胺蓝染色切片、嗜银染色切片分别对神经元细胞数量及大小、神经元细胞轴突发芽及尼氏小体、神经纤维变化情况进行观察，然后对神经元面积变化进行检测和定量分析，检测过程中用计算机图像分析仪〔2～5〕。

1.6 统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1 4组移植手术后2、4、6、8 w的CBS变化 B、C、D组移植手术后2、4、6、8 w的CBS均显著低于A组(P<0.05)，D组移植手术后2、4、6、8 w的CBS又均显著低于B、C组(P<0.05)，但B、C组差异均不显著(P>0.05)，见表1。

表1 4组移植手术后2、4、6、8 wCBS变化(分，

与A组比较：1)P<0.05；与D组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 4组移植手术后2、4、6、8 w的神经元面积变化 B、C、D组移植手术后2、4、6、8 w的神经元面积均显著高于A组(P<0.05)，D组移植手术后2、4、6、8 w的神经元面积又均显著高于B、C组(P<0.05)，但B组、C组差异均不显著(P>0.05)，见表2。

表2 4组移植手术后2、4、6、8 w的神经元面积变化

3 讨 论

由于哺乳动物中枢神经损伤后再生极为困难，因此平面以下下肢瘫痪在脊髓损伤的作用下发生一直是临床研究的难点和重点〔6〕。医学实验表明〔7～10〕，脊髓损伤后由于缺乏对促进神经再生进行诱导的微环境等，因此无法再生，这和周围神经不同。医学实验显示〔11，12〕，宿主脊髓中胚胎脊髓移植能够存活、生长等并促进部位纤维连接的形成，为恢复神经功能提供良好的前提条件。对其应用外源性神经营养因子能够对脊髓神经元萎缩进行有效防止，促进红核脊髓通路的再生。在神经营养因子中，最具感觉及运动神经元活性的是神经生长因子。FSC及外源性神经生长因子均能够有效改善脊髓损伤局部微环境，将良好的前提条件提供给损伤脊髓的神经纤维再生。本研究结果充分说明FSC结合神经生长因子能够有效修复老年大鼠的损伤脊髓功能。

1 刘 佳.脊髓脱细胞支架复合人脐血间充质干细胞促进大鼠脊髓长节段缺损轴突长入再生及功能恢复〔D〕.广州：南方医科大学，2013.

2 刘 炎.人脐带Wharton胶间充质干细胞促进雪旺细胞分泌神经营养因子的实验研究〔D〕.长春：吉林大学，2013.

3 王 勇，赵 伟，冯健洲，等.神经生长因子修饰脂肪干细胞移植促进损伤脊髓的修复〔J〕.中国组织工程研究，2015；10(14)：2224-9.

4 孙兆忠，李 瑞，房清敏，等.脐血干细胞移植及电针治疗脊髓损伤大鼠神经生长因子及神经营养因子3的表达〔J〕.中国组织工程研究，2015；19(1)：61-6.

5 柴 勇，杨 成，张 敏.神经干细胞移植治疗对损伤脊髓大鼠神经生长因子表达的影响〔J〕.实用医学杂志，2013；29(12)：1910-2.

6 刘知泉.温肾助阳益精填髓结合神经生长因子治疗脊髓损伤的临床疗效观察〔J〕.实用中西医结合临床，2014；20(11)：36-7.

7 刘 坤，刘维婕，李 薇.联合应用神经生长因子和神经节苷脂对坐骨神经损伤大鼠脊髓神经元的保护作用探讨〔J〕.中国卫生产业，2014；6(7)：9-10.

8 佘志峰，陈炜炜，蒋功达.神经生长因子结合高压氧治疗脊髓损伤疗效分析〔J〕.现代实用医学，2013；5(1)：63-4.

9 杨 波，隋汝波.电针对大鼠脊髓损伤细胞凋亡相关因子的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(12)：3263-5.

10 田小磊，王 坤，靳安民.内质网应激相关蛋白在大鼠急性脊髓损伤中的表达及其意义〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(20)：5796-8.

11 Bramlett HM，Dietrich WD，Marcillo A，etal.Effects of low intensity vibration on bone and muscle in rats with spinal cord injury〔J〕.Osteoporosis Int，2014；25(9)：2209-19.

12 Menon N，Gupta A，Khanna M，etal.Ambulation following spinal cord injury and its correlates〔J〕.Ann Indian Acad Neurol，2015；18(2)：167-70.

〔2015-02-11修回〕

(编辑 苑云杰)

牡丹江医学院科学技术研究项目(No.ZS201523；ZS201526)

安 宁(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事神经病学研究。

解锦鼎(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事脊髓损伤研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)21-5269-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.024

1 牡丹江医学院红旗医院神经内科