RNA干扰SBF2对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响

李天客 陈 中 包 阳 张素欣

(河北医科大学第四医院口腔科，河北 石家庄 050071)



RNA干扰SBF2对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响

李天客 陈 中 包 阳 张素欣

(河北医科大学第四医院口腔科，河北 石家庄 050071)

目的 探讨RNA干扰SET结合因子2(SBF2)表达对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响。方法 根据SBF2的mRNA序列及siRNA设计原则，设计并合成3条靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3)，以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染取对数生长期SCC15细胞，同时设转染不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC)。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SBF2干扰效率，分别于转染24、48、72 h采用WST-1法评价讨RNA干扰SBF2对SCC15细胞增殖的影响，分别于转染24、48 h后采用Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术和Transwell小室法检测SCC15细胞的凋亡率及穿膜细胞数以评价RNA干扰SBF2对凋亡和侵袭能力的影响。结果 与仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的对照组相比，SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3组SCC15细胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05)，且干扰率由高至低依次为SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1，故选取干扰效率最高的SBF2-siRNA2用于后续实验。与对照组和siRNA-NC组相比，SBF2-siRNA组的增殖抑制率和凋亡率均升高，而穿膜细胞数降低，以上差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组和siRNA-NC组以上指标的无统计学差异(P>0.05)。结论 RNA靶向干扰SBF2表达可抑制人口腔癌细胞增殖及侵袭能力并诱导其凋亡。

RNA干扰；SET结合因子2；口腔癌；增殖；凋亡

口腔癌是头部常见的恶性肿瘤，确切发病机制尚不清楚，临床治疗手段较局限且效果不理想〔1〕。恶性肿瘤的发生发展是一个多基因多途径共同作用的结果，涉及多个基因的异常表达，故探讨影响口腔癌恶性行为的关键基因对于该病的防治有重要意义〔2〕。SET结合因子2(SBF2)是一个新近发现的与癌症相关的一个因子，Wu等〔3〕发现SBF2基因与胰腺癌患者的生存有关，Long等〔4〕研究发现在胰腺癌细胞中靶向沉默SBF2可抑制胰腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，以上提示该基因在胰腺癌发生发展中起一定作用，但目前SBF2基因在口腔癌中的作用效果及方式尚不清楚。为此，本研究设计了3条靶向针对SBF2的小干扰RNA(siRNA)，通过高效转染常用的口腔癌细胞株SCC15以筛选干扰效果最强的siRNA，进一步观察对其增殖、凋亡及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人口腔癌细胞株SCC15购自中国科学院上海细胞库，WST细胞增殖毒性分析试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)购自TBD公司，RPMI 1640培养基及Opti-MEM培养基购自Gibco BRL公司，Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司，胰蛋白酶购自 Promega公司，阳离子脂质体Lipofectamine 2000、Trizol及逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，核酸染料SYBR Green I购自北京鼎国生物科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养 将SCC15细胞复苏后，接种于含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养瓶中，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养，48 h后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态，待达80%～90%融合后，胰酶消化传代。

1.3 小干扰RNA引物设计及转染 根据SBF2的mRNA序列(NM_030962.3)及特异性siRNA引物设计网站(http：//sidirect2.rnai.jp)设计3条靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3)，同时设计不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC)，以上序列均由上海吉玛制药有限公司合成。SBF2-siRNA1：5′-UUUGAAUUCCCAAUUGCUGGA-3′，SBF2-siRNA2：5′-AUUUUCCUGUAUUAAUUCCUG-3′，SBF2-siRNA3：5′-UAAAGAUCUCUACUACUUCUG-3′，siRNA-NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 。

1.4 siRNA转染 于转染24 h前将对数生长期SCC15细胞以2×105个/ml的浓度接种于6孔板，将50 μl含200 pmol 靶向SBF2 siRNA的Opti-MEM培养基及50 μl 含转染试剂Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养基混合5 min，将以上混合物加入2 ml接种SCC15细胞的不含血清及抗生素的RPMI 1640培养基，4 h后采用含血清的培养基替换，培养48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SBF2干扰效率。

1.5 qRT-PCR检测SCC15细胞中SBF2 mRNA水平 采用Trizol试剂提取SCC15细胞中的总RNA，经逆转录试剂盒转录成为cDNA，采用SYBR Green I染料进行RT-PCR扩增，条件：95℃变性3 min，(95 ℃ 30 s+60 ℃ 30 s)共40个循环，72℃ 30 s延伸。采用2-△△Ct进行相对定量分析，计算SBF2相对于内参的表达量。SBF2上游引物：5′-AAGGAGTCTGTATTTGGGAATGT-3′，下游引物：5′-GGCTAGAGACGTTTACATTGGG-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。选取干扰率最高的siRNA进行后续试验，根据siRNA片段转染情况将SCC15细胞共分为SBF2-siRNA组和siRNA-NC组，同时设仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的对照组。

1.6 WST-1法检测细胞增殖 取3组转染后的SCC15细胞，以每孔2×103个接种于96孔板，每组设3个复孔，分别于转染24、48、72 h后向每孔加入WST-1工作液10 μl，继续孵育3 h后，于450 nm波长下采用酶标仪检测吸光值(A)，根据公式计算RNA靶向干扰SBF2相对于对照组的增殖抑制率：抑制率(%)=(A对照组-A干扰组)/A对照组×100%。

1.7 Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术检测凋亡情况 收集3组转染24、48 h的SCC15细胞1×106个，经PBS缓冲液冲洗后，加入200 μl 1 ×Annexin V结合液悬浮细胞，加入10 μl Annexin-FITC，室温避光反应10 min后加入10 μl PI，避光反应15 min后，采用FACSCalibur 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 Transwell小室检测细胞侵袭情况 将3组转染后的SCC15细胞置于已经Matrigel胶包被的Transwell上室，Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，24、48 h后用棉签轻轻擦掉上室侧未穿过膜的细胞以及基质胶，下层侵袭的细胞经4%多聚甲醛固定30 min，自然风干后用1%结晶紫染色，高倍镜下(×400)随机选取5个具有代表性的视野计数穿膜细胞数。实验重复3次。

1.9 统计学处理 采用SPSS18.0软件行单因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用SNK法。

2 结 果

2.1 RNA干扰后SCC15细胞SBF2 mRNA水平变化 与仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的对照组相比，SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3组SCC15细胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05)，且抑制率由高至低依次为SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1，故选取干扰效率最高的SBF2-siRNA2用于后续实验。siRNA-NC组的SBF2 mRNA水平与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 RNA干扰后SCC15细胞SBF2 mRNA水平变化及干扰率

与对照组比较：1)P<0.05；与SBF2-siRNA1组比较：2)P<0.05；与SBF2-siRNA2组比较：3)P<0.05；与SBF2-siRNA3组比较：4)P<0.05

2.2 RNA干扰SBF2对SCC15细胞增殖的影响 SBF2-siRNA组SCC15细胞的增殖抑制率均高于对照组和siRNA-NC组(P<0.05)，且对照组和siRNA-NC组增殖抑制率无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 RNA干扰SBF2后SCC15细胞增殖抑制率变化

与对照组比较：1)P<0.05；与SBF2-siRNA组比较：2)P<0.05,下表同

2.3 RNA干扰SBF2对SCC15细胞凋亡的影响 SBF2-siRNA组SCC15细胞的凋亡率高于对照组和siRNA-NC组(P<0.05)，且对照组和siRNA-NC组凋亡率无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 RNA干扰SBF2后SCC15细胞凋亡率变化

2.4 RNA干扰SBF2对SCC15细胞侵袭的影响 SBF2-siRNA组SCC15细胞的穿膜细胞数低于对照组和siRNA-NC组(P<0.05)，且对照组和siRNA-NC组穿膜细胞数无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表4 RNA干扰SBF2后SCC15细胞穿膜细胞数变化±s,个,n=3)

3 讨 论

SBF2位于11p15.4，尽管其具有一个非活动性磷酸酶结构域，但其可提高MTMR2的催化活性并可能改变MTMR2的细胞定位〔5〕，而MTMR2在细胞内的主要功能为磷脂酰肌醇-3-磷酸酶同时可拮抗某些磷脂酰肌醇-3激酶的活性〔6〕。此外，SBF2与MTMR2构成的复合体可影响某些细胞表面受体的分拣和降解，如介导肿瘤细胞生长的表皮生长因子受体的活性〔7〕，以上提示SBF2可能在肿瘤发生发展中起到一定作用。然而SBF2与口腔癌细胞增殖、凋亡及侵袭的关系目前尚不明确，故本研究设计靶向SBF2的siRNA并转染常用的口腔癌SCC15细胞，采用体外研究的方法观察干扰SBF2表达对SCC15细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。

本研究在转染靶向SBF2的3条siRNA后发现，转染后SCC15细胞中的SBF2 mRNA水平均降低，提示靶向干扰成功，可干扰SBF2表达。细胞的增殖及凋亡过程受到严格的调控，两者的动态失衡是肿瘤难以有效控制的关键，而对于口腔癌细胞，控制增殖及凋亡亦是关键点〔8，9〕。本研究发现，靶向SBF2 siRNA对SCC15细胞活性的抑制作用呈时间依赖性，也表明SBF2在SCC15细胞的增殖过程中发挥重要作用。与Long等〔4〕的研究一致，靶向干扰SBF2表达可抑制胰腺癌细胞PANC-1的增殖，提示该基因可能参与了恶性肿瘤细胞的增殖调控过程，推测可能原因为SBF2可影响与肿瘤增殖相关受体的活性及表达，如表皮生长因子受体等〔6〕。Long等〔4〕亦发现SBF2干扰后PANC-1细胞的凋亡率亦升高，提示该基因同样也参与了对凋亡通路的调节过程，下一步将重点研究沉默该基因对重要凋亡通路的影响。Long等〔4〕指出SBF2干扰可通过抑制TGF-β通路的活性，本研究推测SBF2有可能通过作用TGF-β通路来发挥对SCC15细胞增殖及凋亡的影响。

鉴于复发转移至颈部淋巴结或远处器官是口腔癌治疗失败的主要原因〔10，11〕，故抑制其复发转移有重要临床意义，因此本研究探索干扰SBF2表达对SCC15细胞侵袭的影响。本文结果提示靶向转染SBF2可能成为预防口腔癌复发转移的新靶点，更表明SBF2对癌细胞恶性转换的影响是多个方面的。

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3 Wu C，Kraft P，Stolzenberg-Solomon R，etal.Genome-wide association study of survival in patients with pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Gut，2014；63(1)：152-60.

4 Long J，Liu Z，Wu X，etal.siRNA-mediated SBF2 silencing may inhibit pancreatic cancer cells via attenuation of the TGF-β signaling pathway〔J〕.Technol Cancer Res Treat，2016；15(2)：308-13.

5 Senderek J，Bergmann C，Weber S，etal.Mutation of the SBF2 gene，encoding a novel member of the myotubular in family，in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/11p15〔J〕.Hum Mol Genet，2003；12(3)：349-56.

6 Berger P，Tersar K，Ballmer-Hofer K，etal.The CMT4B disease-causing proteins MTMR2 and MTMR13/SBF2 regulate AKT signaling〔J〕.J Cell Mol Med，2011；15(2)：307-15.

7 Tersar K，Boentert M，Berger P，etal.Mtmr13/Sbf2-deficient mice：an animal model for CMT4B2〔J〕.Hum Mol Genet，2007；16(24)：2991-3001.

8 万英明.重组人乳铁蛋白对口腔癌Tca8113细胞周期及周期调控因子cyclinD1、p19和 p27基因表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(5)：1323-4，1325.

9 强 璐，柴楣才.PPAR-γ对口腔癌细胞转移能力的影响及其机制〔J〕.山西医科大学学报，2012；43(11)：817-21.

10 陈国栋，卿安蓉.近距离腔内照射联合外照射治疗控制口腔癌术后复发的临床效果评价〔J〕.医学综述，2015；21(6)：1144-5，1150.

11 李莎莎，周 旋，张浏阳，等.口腔舌癌与口底癌患者预后的比较研究〔J〕.天津医药，2013；41(6)：523-6.

〔2015-10-19修回〕

(编辑 徐 杰)

张素欣(1974-)，女，副主任医师，博士，主要从事口腔癌的综合治疗研究。

李天客(1983-)，男，主治医师，硕士，主要从事口腔癌的综合治疗研究。

R73

A

1005-9202(2016)21-5260-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.020