H2松弛素对慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯伟 王 洁

(丽水市人民医院呼吸内科，浙江 丽水 321400)



H2松弛素对慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯伟 王 洁

(丽水市人民医院呼吸内科，浙江 丽水 321400)

目的 探讨H2松弛素对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支气管平滑肌增殖的抑制作用。方法 观察正常对照组、COPD模型组及松弛素治疗组大鼠肺组织的病理变化，比较各组大鼠支气管壁及平滑肌厚度，检测基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1 表达水平及MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值。结果 与正常对照组大鼠相比，COPD模型组大鼠肺支气管壁及平滑肌厚度显著增厚，且松弛素治疗组大鼠肺支气管壁厚度及平滑肌厚度与COPD模型组大鼠相比显著降低(P<0.05)。COPD模型组大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表达水平均高于正常对照组(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值与正常对照组相比，呈现明显升高趋势(P<0.05)；而对比COPD模型组大鼠，松弛素治疗组大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表达有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值与COPD模型组相比均降低(P<0.05)。结论 松弛素能抑制大鼠肺组织结构病理变化，抑制COPD气道平滑肌的增殖。

松弛素；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；基质金属蛋白酶(MMP)；基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的致病因素很多，其发病机制尚不明确〔1〕。国外研究〔2〕证实，当小鼠缺乏H2松弛素时，会表现出肺部变性，质量增加，生成大量胶原及纤维，肺泡产生病理改变，出现充血，可伴有水肿，同时支气管上皮细胞出现增厚等病理变化，出现类似衰老的表现，因此补充H2松弛素可使得上述病理变化出现逆转，且发现这一病理变化过程极有可能通过影响了肺及平滑肌中基质金属蛋白酶 (MMP)-1、MMP-9及MMP组织抑制剂(TIMP)-1的表达而实现。本实验采用脂多糖(LPS)滴注大鼠气道，联合被动吸烟法制备COPD的大鼠模型〔3〕，探讨H2松弛素对COPD模型中大鼠的支气管平滑肌增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 选取鼠龄12 w、体质量(200±20)g的 Wistar大鼠30只，随机分为正常对照组、COPD模型组和松弛素治疗组。COPD模型组和松弛素治疗组分别于造模的第1以及第15天，向大鼠的气道内滴注一定量的LPS，浓度为200 μg/200 μl，正常对照组不作任何处理。造模第2天将COPD模型组和松弛素治疗组大鼠放入有机玻璃熏箱内，每次吸烟10支，大约2 h，每天吸烟2次(上、下午各一次)，每周吸烟6 d，共吸烟20 w。松弛素治疗组在造模开始第30天开始每天皮下注射松弛素(0.25 mg·kg-1·d-1)15 d，正常对照组采用生理盐水注射15 d。检测模型制定成功的标准：随机选取COPD造模组大鼠，切取肺组织做病理分析，观察其肺部组织是否出现类似COPD的病理变化。大鼠肺部的外周气道、主支气管及细支气管以及血管壁均出现炎细胞浸润，气道损伤；镜下可见黏液腺肥大增生，杯状细胞增多；平滑肌以及肺小动脉平滑肌均出现增生，胶原沉积进而出现气道腔缩小狭窄，导致气道出现阻塞；出现细支气管呼吸相扩张、受损，肺泡因压力导致增大，形成不规则的肺大泡。

1.2 收集标本 采用浓度(50 mg/kg)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后断头处死，取材部位为：心、右下肺叶，所有组织储存于液氮罐中。向左侧主支气管注入4%多聚甲醛，致使大鼠出现轻度肺膨胀，按照0.5 cm厚度切取左侧中下肺叶，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，采用石蜡垂直包埋，垂直于支气管及细支气管横断面、矢状位切片。HE染色行病理学观察。同时测量各组大鼠支气管壁及平滑肌的厚度。

1.3 检测大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表达 采用免疫组织化学过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)测定。镜下结果采用图像分析系统统计，随机挑选镜下6个画面，当细胞质及胞膜出现棕褐色颗粒则计为阳性表达，采用平均吸光度值测定表达强度，吸光度值越高提示所测指标含量越高。试剂盒采用美国Zymed公司SP试剂盒。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差及LSD-t检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺-支气管的病理学变化 正常对照组大鼠镜下可见肺结构大体正常，肺小叶结构组织无明显异常，支气管未见明显异常；COPD模型组大鼠细支气管纤毛部分出现滑落，粘连，倒伏，黏液腺较正常大鼠增大，杯状细胞及嗜酸性细胞浸润增多，管壁明显增厚，管腔狭窄，伴有大量中性粒细胞、浆细胞及淋巴细胞的浸润，上皮细胞膨胀出现变形、细胞坏死倾向，肺泡间隔较正常肺泡变薄、部分出现断裂，肺泡腔增大，甚至出现融合，松弛素治疗组大鼠肺部组织也出现上述病理变化，但程度较COPD模型组大鼠病理改变减轻。

2.2 各组大鼠肺支气管壁及平滑肌厚度比较 与正常对照组大鼠相比，COPD模型组大鼠肺支气管壁及平滑肌厚度显著增厚，且松弛素治疗组大鼠肺支气管壁厚度及平滑肌厚度与COPD模型组大鼠相比显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表达水平 COPD模型组大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三者的表达水平均高于正常对照组(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值与正常对照组相比，呈现明显升高趋势(P<0.05)；而对比COPD模型组大鼠，松弛素治疗组大鼠组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表达有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值与COPD模型组相比均降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组肺支气管壁及平滑肌厚度、肺组织MMP-1、MMP-9、TIMP-1 表达水平比较±s,n=10)

与正常对照组比较：1)P<0.05；与COPD模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

MMPs是一组降解肺组织细胞外基质的最主要的酶系，可降解肺泡壁中全部细胞外基质成分，激活其他不同类型的MMPs等作用。TIMPs为一种内源性抑制剂，可抑制MMPs的活化〔6〕。TIMPs可由上皮细胞、内皮细胞等产生，是MMPs的内源性抑制剂，具备生长因子样作用，可促使成纤维细胞增生，使细胞外基质沉积并抑制其降解。TIMPs与MMPs两者以共价键形式形成复合体，进而阻止MMPs与相应底物结合，而TIMPs与MMPs这种结合具有不可逆性〔7〕。MMPs/TIMPs的比例改变是导致COPD气道重塑的主要机制之一，而当COPD发生时，肺组织结构改变，如支气管壁增厚，平滑肌增厚，从而导致功能下降，气道发生不可逆改变，通气功能下降，病理发现，支气管壁以及平滑肌中出现大量炎症细胞，嗜酸性粒细胞浸润，原有结构发生改变，胶原沉积，纤维化改变等，以上均是导致支气管功能下降的主要因素。

Comer等〔8〕研究显示，在对比健康者和肺气肿患者肺泡巨噬细胞中mRNA水平和蛋白酶的活性后发现，吸烟者肺部间质中胶原酶和巨噬细胞的明胶酶B表达增多，肺气肿患者肺泡巨噬细胞的活性显著增高。Segura-Valdez等〔7〕发现在肺气肿患者肺组织中MMP-1高表达，MMP-9的表达在吸烟相关的肺气肿中也呈现明显增高，Raulo等〔9〕发现COPD表现的马的支气管肺泡灌洗液中MMP-9的表达水平明显高于健康马，且与炎症细胞呈正相关。TIMP-1广泛存在于人体组织及血液中，具有较高的结合力，可与所有的MMPs家族成员形成复合物，从而抑制MMP-9的活性，进而导致蛋白水解酶活性丧失。TIMP-1的表达是否异常关系到肺部组织结构重塑〔10〕，研究发现TIMPs还具促细胞因子样作用，促进细胞外基质沉积并抑制降解，其过程与气道修复、重塑相近。松弛素属于胰岛素类生长激素家族的蛋白激素，其结构和胰岛素相似，分子大小约6 kD，含有A和B两个肽链，由二硫键连接组成〔4〕。研究发现，松弛素与其受体结合时，可致使其受体发生构象的改变，导致松弛素受体被激活，此激活途径，进一步引起受体内细胞内信号转导通路出现激活〔5〕。目前发现的松弛素基因，分别为H1、H2和H3，而H2主要存在于其组织及血液循环系统中。当松弛素与其受体结合时，血管内皮MMPs的活性可相应增强。

本研究提示COPD模型复制成功，大鼠出现肺部组织结构破坏，支气管壁及平滑肌厚度显著增加，且修复重构也同时进行，此结果与目前研究认为MMPs和TIMPs的动态平衡与气道及肺组织破坏与修复同时存在相一致的理论〔11〕。而MMPs和TIMPs表达是否平衡是导致大鼠肺部各组织结构正常与否及维持细胞外基质正常的基础条件之一，两者失衡会出现病理变化。MMPs/TIMPs比值增加提示组织破坏加剧，下降则提示组织纤维化气道重塑。

国外研究〔12〕证实松弛素缺失的小鼠会出现与衰老相关的胶原含量增加、肺组织质量增加、肺泡充血和细支气管壁增厚，平滑肌增厚功能下降，而通过H2松弛素的治疗可以使过多的胶原沉积得到逆转。本实验提示H2松弛素可能是通过抑制COPD气道平滑肌的增殖，延缓COPD的进展，进而起到一定程度的治疗作用。

1 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版) 〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2013；36(4)：255-64.

2 McGowan BM，Minnion JS，Murphy KG，etal.Central and peripheral administration of human relaxin-2 to adult male rats inhibits food intake 〔J〕.Diabetes Obes Metab，2010；12(12)：1090-6.

3 许三林，汤光宗，钱敏玉，等.实验性吸烟小鼠气道上皮细胞凋亡与慢性阻塞性肺疾病发生机制的研究〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2003；3(3)：169-73.

4 Teerlink JR，Cotter G，Davison BA，etal.Serelaxin，recombinant human relaxin-2，for treatment of acute heart failure (RELAX-AHF)：a randomised，placebo-controlled trial〔J〕.Lancet.2013；381(9860)：29-39.

5 韩曙光，吕蓓丽，丁晓婧，等.H2型松弛素对慢性支气管哮喘小鼠气道重塑与肺组织组织周期蛋白D1表达的影响〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2012；35(5)：349-54.

6 赵 华，赵 瑾，许西琳.COPD大鼠模型气道MMP-9和TIMP-1表达的研究〔J〕.现代生物医学进展，2010；12(10)：2244-6.

7 Segura-Valdez L，Pardo A，Gaxiola M，etal.Up-regulation of gelatinases A and B，collagenases 1 and 2，and increased parenchymal cell death in COPD〔J〕.Chest，2000；117(3)：684-94.

8 Comer D，Kidney J，Ennis M，etal.Airway epithelial cell apoptosis and inflammation in COPD，smokers and non-smokers〔J〕.Eur Respir J，2012；9(9)：1342-7.

9 Raulo SM，Sorsa T，Tervahartiala T，etal.MMP-9 as a marker of inflammation in tracheal epithelial lining fluid (TELF) and in bronchoalveolar fluid (BALF)of COPD horses〔J〕.Equine Vet J，2001;33(2)：128-36.

10 Tanaka H，Miyazaki N，Oashi K，etal.Sputum matrix metalloproteinase-9：tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio in acute asthma〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2000；105(5)：900-5.

11 Mercer PF，Shute JK，Bhowmik A，etal.MMP-9，TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation〔J〕.Respir Res，2005；6(1)：151.

12 Lee JH，Lee DS，Kim EK，etal.Simvastatin inhibits cigarette smoking induced emphysema and pulmonary hypertension in rat lungs〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005；172(8)：987-93.

〔2015-07-19修回〕

(编辑 赵慧玲/曹梦园)

李 露(1987-)，女，住院医师，主要从事肺部感染、肺癌研究。

R56

A

1005-9202(2016)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.016