枸橼酸预处理对缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表达的影响

李艳芳 费丽萍 牛青英 韩泽红

(长治医学院附属和济医院心内科，山西 长治 046011)



枸橼酸预处理对缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表达的影响

李艳芳 费丽萍 牛青英 韩泽红1

(长治医学院附属和济医院心内科，山西 长治 046011)

目的 探讨枸橼酸预处理对心肌缺血再灌注(I/R)大鼠室性心律失常的影响及相关作用机制。方法 选择雄性SD大鼠350～400 g，随机分为假手术组、模型组、枸橼酸组(0.05 mol/L)，每组10只，采用结扎冠状动脉左前降支法建立在体大鼠I/R模型，缺血30 min，再灌注120 min，记录心电图，检测预处理前后血清钙离子浓度变化，TTC染色法测定梗死面积，活性分光光度法测定心肌组织Caspase-3蛋白表达水平，PCR测定心肌钙调蛋白(CAM)表达水平。结果 模型组室性心律失常次数显著高于假手术组(P<0.05)，枸橼酸组低于模型组、高于假手术组(P<0.05)；枸橼酸处理后血清钙离子浓度显著低于处理前(P<0.05)，有一定时间规律；枸橼酸组梗死面积显著低于模型组(P<0.05)，Caspase-3蛋白、CAM表达水平显著低于模型组(P<0.05)。结论 枸橼酸对I/R大鼠心肌保护作用与降低血清钙离子浓度，下调Caspase-3蛋白、CAM表达水平，降低心肌细胞凋亡，减轻室性心律失常有关。

枸橼酸；室性心律失常；Capase-3

心肌缺血再灌注(I/R)可加重缺血导致的心功能障碍与心肌细胞损伤，阐明其作用机制对于预防心肌I/R损伤有重要作用〔1〕。细胞内钙超载在心肌I/R损伤中具有主导作用〔2〕，细胞内Ca2+失衡导致Ca2+分隔与Ca2+内流失调，引发心肌细胞内Ca2+超载，心肌缺血缺氧时线粒体产生ATP减少，钙泵功能受限制，Na+/Ca2+交换蛋白为非ATP依赖性转运蛋白，导致细胞内Na+水平增加及酸中毒，心肌再灌注时pH与ATP恢复，细胞内外pH梯度差激活Na+/H+与Na+/Ca2+交换，胞外Ca2+内流，导致细胞内钙超载，在心肌动作电位后短暂除极，引发室性心律失常〔3〕。枸橼酸多作为血液抗凝剂，可与Ca2+形成络合物枸橼酸钙，降低血中Ca2+，抑制凝血过程。本研究观察枸橼酸预处理对I/R大鼠室性心律失常、血清Ca2+浓度及心肌组织Caspase-3蛋白、心肌钙调蛋白(CAM)表达水平的影响，从分子水平探讨其在I/R损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 选择健康雄性10周龄的SD大鼠，体重350～400 g，由中国医学科学院动物实验中心提供(许可证号：SYXK-2013-0025)，SPF级动物实验室，饮食进水均符合实验动物标准。随机分为假手术组、模型组、枸橼酸组，每组10只。枸橼酸组在再灌注前10 min尾静脉注射枸橼酸0.05 mol/L，给药体积为1 ml(按照临床成人用量等效剂量换算)，后用50 μl生理盐水插管，假手术组、模型组给予等体积生理盐水。

1.1.2 试验药物与试剂 枸橼酸(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、乌拉坦(购自于Sigma公司)，每个标本0.1 g TTC溶于5 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，现配现用，避光。Caspase-3试剂盒(购自南京碧波生物科技公司)，BCATM Protein Assay Kit(23337，Pierse.USA)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 参考文献方法建立大鼠I/R模型〔4〕。采用5%乌拉坦腹腔麻醉，尾静脉置入24G套管留置针，大鼠仰位固定，连接肢体导联心电图(ECG)Ⅱ导联，颈部气管切开置管连接小动物呼吸机控制大鼠呼吸(潮气量8 ml/kg，呼吸频率70次/min，吸呼比1∶2)，分离左颈总动脉，将硬膜外麻醉导管插入连接电生理信号记录仪，左冠状动脉前降支根部穿结扎线，假手术组只穿线不结扎冠状动脉，其余各组均缺血30 min后再灌注2 h，记录心电图变化。缺血模型判断：左冠状动脉前降支结扎5 min后，Ⅱ导联ST抬高或QRS波群振幅增加、增宽与T波融合；动脉血压降低>20 mmHg，结扎血管支配区室壁发绀。再灌注模型判断：缺血区发绀消失，再灌注30 min后抬高ST段降低>50%；排除再灌注前严重房室传导阻滞，结扎前平均动脉压<60 mmHg。大鼠缺血再灌注120 min ECG记录中出现室性心律失常：室性早搏高峰期1～5 min、15～19 min、35～55 min。处死大鼠，取心组织，测定预处理前后血清Ca2+浓度，TTC染色法测定梗死面积，活性分光光度法测定心肌组织Caspase-3蛋白表达水平，PCR测定CAM表达水平。

1.2.2 TTC染色法测定梗死面积 取心脏PBS冲洗后取左心室于-80℃冰冻5 min后切片，置于1%pH 8.5的TTC溶液，37℃孵育0.5 h，梗死区域未着色，正常组织染成红棕色，采用Image pro plus6.0软件分析梗死面积，计算左室缺血面积占左心室面积百分比(AAR/LV)。

1.2.3 分光光度法测定心肌组织Caspase-3活性 取心脏左室部分缺血区心肌组织，制备心肌组织匀浆，BCATM Protein Assay Kit法测定蛋白水平，比色法测定心肌组织Caspase-3活性，按照试剂盒说明书测定。

1.2.4 PCR法测定CAM蛋白表达 以反转录cDNA为模板进行PCR扩增，CAM序列正向引物：5'-GCTGCCTCTTCAAAATCGCC-3'，反向引物：5'-CTCTGCACTGTGTACCTCGG-3'。采用实时荧光定量PCR仪检测，20 μl PCR反应体系，50℃ 2 min，95℃ 10 min后循环40次(95℃ 30 s，60℃ 30 s)，60℃采集荧光信号。

2 结 果

2.1 枸橼酸预处理对室性期前收缩发生次数、联律、室速、室颤发生的影响 与对照组比较，模型组室性期前收缩发生次数明显增加(P<0.05)，枸橼酸组室性早搏次数与模型组比较降低(P<0.05)。与模型组比较，枸橼酸组联律、室速的平均发生次数显著降低(P<0.05)。模型组室颤发生率为10%，发生次数为1次，持续时间为10.45 s，其余各组无室颤发生。见表1。

表1 枸橼酸预处理对室性早搏发生次数、联律、室速发生情况影响±s,次,n=10)

与假手术组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 枸橼酸预处理对血清Ca2+浓度的影响 枸橼酸预处理后血清Ca2+浓度低于预处理前，干预10 min后达峰谷，干预30 min后血清Ca2+浓度上升。见图1。

图1 枸橼酸预处理对血清Ca2+浓度的影响

2.3 枸橼酸预处理对I/R大鼠心肌梗死AAR/LV、心肌组织Caspase-3蛋白表达的影响 枸橼酸组AAR/LV显著低于模型组(P<0.05)。假手术组Caspase-3表达水平为1，与模型组比较，枸橼酸组Capase-3显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 枸橼酸预处理对心肌梗死AAR/LV、心肌组织Capase-3蛋白表达影响

2.4 枸橼酸预处理对I/R大鼠心肌组织CAM表达影响 与假手术组比较，模型组CAM表达显著升高，枸橼酸组CAM表达明显降低。见图2。

图2 枸橼酸预处理对I/R大鼠心肌组织CAM表达影响

3 讨 论

心肌I/R损伤导致恶性心律失常，心肌梗死后发生心律失常重要原因为心室电重构，心肌细胞膜离子通道结构与功能变化在心律失常发生过程中有重要作用〔5～7〕，L-Ca2+通道开放及动作电位延长引起早后除极，钙超载在心肌I/R心律失常病理过程中具有重要作用，缺血缺氧Na+-K+ATP酶活性下降，Na+-H+交换增加，胞内Na+超载，引发Na+-Ca2+交换，缺氧ATP生成减低，抑制肌浆网摄取及释放Ca2+，胞质Ca2+积聚，再灌注时补充了高能磷酸化合物，肌浆网摄取释放Ca2+，细胞内堆积大量钙离子，延迟后除极幅度升高，引发室性心律失常〔8～10〕。本研究结果表明，枸橼酸可抑制大鼠I/R时室性心律失常。

心肌细胞L型钙通道电流主要离子成分为Ca2+，L-Ca-L作为主要内心离子流参与心肌细胞动作电位复极化及窦房结起搏过程，激活肌浆网释放Ca2+，维持正常心律，参与心肌细胞兴奋-收缩耦联与心肌细胞电活动，增加心肌收缩力〔11〕。本研究结果表明，枸橼酸处理后血清Ca2+浓度显著低于处理前，有一定时间规律，说明枸橼酸螯合细胞外Ca2+作用较强。细胞外Ca2+经过Ca2+通道形成钙电流，在慢反应细胞中参与自动除极，在快反应细胞参与形成超射。细胞凋亡在I/R损伤病理过程中发挥作用，细胞凋亡与氧自由基、细胞内钙超载等多因素有关，凋亡触发因素激活Caspase家族，引发瀑布级联反应导致细胞凋亡，Caspase-3处于核心位置，心肌细胞凋亡与Caspase-3高表达区域在相同心肌缺血区域。本研究结果显示，心肌I/R过程心肌细胞凋亡增加，枸橼酸组Caspase-3蛋白表达下降，缺血早期主要为细胞凋亡，随缺血程度增加发生心肌坏死，再灌注后由于细胞内钙超载、大量自由基产生等促进不可逆性细胞凋亡，加重I/R损伤，枸橼酸干预可通过抗凋亡作用保护心肌组织。

枸橼酸干预可减轻心肌缺血后钙内流导致的细胞内钙超载，改善心肌电重构，心肌缺血缺氧抑制了心室肌细胞L-Ca-L，峰值电流下降，缩短肌细胞动作电位2相时程，心肌复极加速，导致各部位心室肌复极不统一，引发室性心律失常；L-Ca-L峰值电流降低一方面降低了Ca2+调节肌浆网作用，引发细胞内钙超载形成震荡性后电位，通过触发活动引发室性心律失常，另一方面由于细胞内Ca2+水平升高激活细胞凋亡信号通路，促进凋亡基因表达，引发细胞凋亡，心肌梗死面积与心肌细胞凋亡程度有关，枸橼酸对I/R大鼠心肌保护作用与降低血清Ca2+浓度，下调Capase-3蛋白、CAM表达水平，降低心肌细胞凋亡，减轻室性心律失常有关。

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〔2015-12-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

李艳芳(1975-)，女，硕士，副主任医师，主要从事冠心病的诊断和治疗工作。

R54

A

1005-9202(2016)21-5249-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.015

1 长治医学院附属和济医院急诊科